Секвенирование по Сэнгеру

Дидезоксинуклеотидный метод, или метод «обрыва цепи», был разработан Ф. Сенгером в 1977 году и в настоящее время широко используется для определения нуклеотидной последовательности ДНК. При секвенировании по Сенгеру происходит гибридизация синтетического олигонуклеотида длиной 17—20 звеньев со специфическим участком одной из цепей секвенируемого участка. Этот олигонуклеотид является праймером, поставляющим 3'-гидроксильную группу для инициации синтеза цепи, комплементарной матрице.

Раствор с праймером распределяют по четырём пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них — меченный радиоактивным изотопом) и один из четырёх 2',3'-дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP). Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается.

В результате этого в каждой из четырёх пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность. Далее в пробирки добавляют формамид для расхождения цепей и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырёх дорожках. Проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть» нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК.

В более современном варианте дидезоксинуклеотиды метят четырьмя разными флуоресцентными красителями и проводят ПЦР в одной пробирке. Затем во время электрофореза в полиакриламидном геле луч лазера в определённом месте геля возбуждает флуоресценцию красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель. Современные приборы используют для секвенирования ДНК капиллярный электрофорез

Высокопроизводительное секвенирование

Данная технология представляет собой последовательный синтез методов эмульсионного ПЦР ипиросеквенирования.

Амплификация ДНК проходит в каплях воды в масляной эмульсии. В каждой капле воды находится одноцепочечная матрица ДНК, связанная с праймером на бусинке. Далее, каждая бусина помещается на чип, представляющий собой оптическое волокно. Туда же помещаются необходимые для секвенирования ферменты: ДНК-полимераза, люцифераза, АТФ-сульфурилаза. В последней сборке реакция секвенирования идет в ячейках объемом 3,4·10⁶ пкл, на стенках которых есть специальное металлическое покрытие, нивелирующее шум.

Методы изучения микрофлоры тела человека: культуральный, молекулярно-генетический.

Культуральный метод - это этап бактериологических исследований. Для выявления и определения возбудителя инфекционного заболевания проводят посев материала от больного на питательные среды. После выделения культуры (чистых колоний микроорганизма) проводят лабораторное изучение свойств и определение возбудителя. С помощью культурального исследования можно выявить заболевания, вызванные не только болезнетворной, но и условно-болезнетворной микрофлорой. Это наиболее дорогостоящий и длительный, но очень точный метод исследований, на основании результатов которого назначают антибактериальную терапию. Для проведения бактериологического посева необходимы сведения о предварительном диагнозе. Материал от больного сеют на питательную среду и помещают в определенные условия (температура, доступ или отсутствие кислорода и др.). Условия выращивания культуры и питательные среды подбирают в зависимости от возбудителя, который предположительно собираются получить на основании предварительного диагноза. По возможности используют элективные питательные среды, на которых растет только определенный вид микроорганизмов. Универсальной питательной средой является кровяной агар - в такой среде растут большинство микроорганизмов, особенно относящихся к условно-болезнетворным. Бактериологическое исследование занимает обычно 3-е суток. В это время при необходимости больному назначают антибиотики широкого спектра действия. После получения заключения исследования лечение корректируют. Недостатком этого метода являются особые требования к забору материала от больного, в качестве которого выступают кровь, кал, моча, соскобы с кожи и слизистых. Биоматериал от пациента берут до начала антибактериальной терапии в стерильную герметично закрытую емкость.