ЗАНЯТИЕ №13

«ДЕЙСТВИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА МИКРООРГАНИЗМЫ. АНТИБИОТИКИ. БАКТЕРИОФАГИ»

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:

• изучить действие на микробы биологических факторов; химиотерапевтические вещества.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

• Биологические факторы, влияющие на микроорганизмы.

• Химиотерапия. Понятие о химиотерапевтических препаратах и химиотерапевтическом индексе. Принципы антимикробной терапии.

• Классификация антибиотиков по химическому строению, происхождению, механизму и спектру антимикробного действия, способам получения.

• Методы изучения антибиотикочувствительности бактерий.

• Механизмы лекарственной устойчивости возбудителей инфекционных болезней. Пути ее преодоления.

• Осложнения антибиотикотерапии, их предупреждение.

• Бактериофаги (умеренные и вирулентные). Принципы применения в медицине.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

• определять чувствительность бактерий к антибиотикам и бактериофагам; расшифровать антибиотикограмму.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ИМЕТЬ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ

• о возможности использования бактериофагов для выявления источников инфекции (эпидемическое маркирование - метод фаготипирования).

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Работа № 1. Фитонциды

Цель работы: определить действие фитонцидов чеснока на микроорганизмы (сарцину, кишечную палочку, стафилококк). Объяснить, почему препараты из фитонцидов не нашли широкого применения в медицине.

Сарцина

Стафилококк

Кишечная палочка

Результат:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Фитонциды – это__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Механизм воздействия на микробную клетку_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Работа № 2. Методы изучения антибиотикочувствительности

• Метод бумажных дисков

Цель работы: определить чувствительность бактериальной культуры к антибиотикам по алгоритму. Зарисовать, сделать вывод

а) Замерить на чашке со средой АГВ (агар Гурьева-Васильева) диаметр задержки роста (зона задержки роста) в мм.

Результат:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

б) По таблице оценить полученные результаты, данные внести в таблицу

№ п/п	Название антибиотика	Диаметр задержки роста (мм)	Устойчивые	Умеренно - устойчивые	Чувствительные

Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

• Метод серийных разведений

Цель работы: определить титр пенициллина с истекшим сроком годности. Дать заключение о его пригодности, учитывая, что титр пенициллина (МИК) должен быть равен 0,062 ЕД.

Номер пробирки	Разведение антибиотика	концентрация антибиотика, мкг/мл	Исследуемая культура, мл		Рост бактерий (помутнение среды)
1	1:100	100	0.1
2	1:200	50	0.1
3	1:400	25	0.1
4	1:800	12,5	0.1
5	1:1600	6,25	0.1
6	1:3200	3,12	0.1
7	1 мл бульона без антибиотика			0.1

Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят по таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.

К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков. К умеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.

Дано:

Пенициллин

6,25 3,125 1,56 0,78 0,39 0,154 0,062 к.к. к. а/б к.б

Результат:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Антибиотики – это__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Классификация антибиотиков:

По способу выделения:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

3.___________________________________________________________________________

4.___________________________________________________________________________

5.___________________________________________________________________________

По спектру действия:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

По механизму действия:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

3.___________________________________________________________________________

4.___________________________________________________________________________

5.___________________________________________________________________________

Возможные осложнения со стороны макроорганизма:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Способы получения антибиотиков:

1.___________________________________________________________________________

2.___________________________________________________________________________

3.___________________________________________________________________________

Работа № 3. Методы изучения бактериальных вирусов (фагов)

Цель: Ознакомиться с методами изучения бактериальных вирусов (фагов)

а) Метод Отто

Цель работы: учесть результат опыта по определению видовой принадлежности исследуемой культуры, выделенной от больного с кишечной инфекцией с помощью диагностических бактериофагов.

Дано: культура и бактериофаги: 1. Коли-протейный, 2.Дизентерийный, 3.Сальмонеллезный

Результат:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

б) Фаготипирование бактерий

Цель работы: сравнить результаты анализов по определению фаговара:

1. стафилококка, выделенного из мази;

2. стафилококка, выделенного из зева фармацевта, готовившего мазь;

3. стафилококка, выделенного от больного, применявшего мазь с лечебной целью.

Стафилококк из мази Стафилококк из Стафилококк от больного

зева фармацевта

Результат:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ СПРАВКА

к Работе №1

Фитонциды - антибиотики, образуемые высшими растениями. Подробное изучение антибиотических веществ высших растений было проведено русским ученым Б. П. Токиным (1951 г). Продуцентами являются эвкалипт, лук, чеснок черемуха, сосна и др. В настоящее время изучено большое число антибиотиков образуемых высшими растениями, некоторые из них получены в химически чистом виде. Это аллицин, рафанин и др. Однако следует знать, что большинство из них является эфирными соединениями и в результате этого при изготовлении и хранении быстро утрачивают антимикробную активность.

к Работе №2

Метод бумажных дисков

Бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар в чашку Петри.

На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посев инкубируют при 37°С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам.

Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов.

Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность методом серийных разведений.

Метод серийных разведений

Данным методом определяют минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) антибиотика. Вначале готовят основное раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл ил] ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащие 106-107 бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульон и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37°С до следующего дня.

Результат оценивается по помутнение питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя пробирка прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий под влиянием содержащейся в ней минимальной ингибирующей концентрации антибиотика.

к Работе №3

Диагностические и лечебно-профилактические бактериофаги

Применяемые на практике препараты бактериофагов представляют собой фильтрат бульонной культуры соответствующих микробов, лизированных фагом, содержащий живые частицы фага, а также растворённые антигены бактерий, освободившиеся из бактериальных клеток при их лизисе. Полученный препарат - жидкий бактериофаг должен иметь вид совершенно прозрачной жидкости жёлтого цвета большей или меньшей интенсивности.

Для применения с лечебно-профилактическими целями фаги могут выпускаться в форме таблеток с кислотоустойчивой оболочкой. Таблетированный сухой фаг более стабилен при хранении и удобен при применении. Одна таблетка сухого бактериофага соответствует 20-25 мл жидкого препарата. Срок годности сухого и жидкого препарата - 1 год. Жидкий бактериофаг следует хранить при температуре + 2 +10 С, сухой- не выше +1°С, но его можно хранить в холодильнике и при отрицательной температуре.

Принятый внутрь бактериофаг сохраняется в организме в течение 5-7 дней. Как правило, прием бактериофага не сопровождается какими-либо реакциями или осложнениями. Противопоказаний к приёму нет. Применяются в виде орошений, полосканий, примочек, тампонов, инъекций, а также вводят в полости - брюшную, плевральную, суставную и в мочевой пузырь.

Диагностические фаги выпускаются как в жидкой, так и сухой форме в ампулах. На ампулах указан титр, ДРТ (доза рабочего титра) или тип. Перед началом работы сухой бактериофаг разводится. Применяют в реакции фаголизабельности (метод Отто) или фаготипирования.

Схема описания бактериофагов:

Название препарата…………………

Классификационное положение: бактериофаг

Действующее начало: бактериофаг

Получение: фильтрат фаголизата бульонной культуры соответствующего микроорганизма

Применение: лечебно-профилактические - для лечения и профилактики соответствующих инфекций;

диагностические - для идентификации микроорганизмов

Способ применения: Действие бактериофага на микробную культуру в жидкой среде и на плотной среде

Метод Отто (стекающая капля)

Делают густой посев газоном исследуемой культуры. Через 5-10 мин после посева на подсушенную поверхность питательной среды наносят жидкий диагностический фаг. Чашку слегка наклоняют, чтобы капля фага растеклась по поверхности агара. Чашку помещают в термостат на 18-24 часа. Учёт опыта производят по полному отсутствию роста культуры в месте нанесения капли фага.

Опыт на жидкой питательной среде

Делают посев исследуемой культуры в две пробирки с жидкой средой. В одну пробирку («О») добавляют петлёй диагностический бактериофаг. Через 18-20 часов в пробирке, куда бактериофаг не добавлялся («К»), наблюдается сильное помутнение бульона — произошел рост посеянной культуры. Бульон в пробирке, куда был добавлен бактериофаг, остался прозрачным вследствие лизиса культуры под его влиянием.

Метод титрования фага

Титрование фагов проводится на культурах бактерий в жидких и плотных средах с целью определения их активности

Метод Аппельмана

Данный метод основан на внесении одной и той же дозы культуры гомологичных микробов в различные концентрации титруемого бактериофага в мясопептонном бульоне.

Готовят десятикратные разведения исследуемого бактериофага в МПБ. Для этого в ряд пробирок разливают по 4,5 мл МПБ. В 1-ю пробирку добавляют 0,5 мл исследуемого фага. Тщательно перемешивают и переносят в последующие пробирки (из пробирки в пробирку) по 0,5 мл соответствующего разведения фага с уменьшением его концентрации в десять раз. Получают разведения 10"1 степени и т.д. до 10~9 степени. После этого в пробирки вносят по 1 капле суточной культуры соответствующих бактерий. За титр бактериофага принимают то его максимальное разведение, при котором наблюдается полный лизис культуры.