підручники. біохімія / Березов_Коровкин - Биологическая химия

N (имидазол)

О2

Рис. 2.1. Координационные связи атома железа в молекуле гема. Все 4 связи с атомами азота пиррольных колец расположены в одной плоскости, 5-я и 6-я

координационные связи (с атомом азота имидазольного кольца гистидина и с кислородом соответственно)–по разные стороны перпендикулярно к этой плоскости.

(от англ. adult–взрослый) содержатся четыре полипептидные цепи, которые вместе составляют белковую часть молекулы–глобин. Две из них, называемые α-цепями, имеют одинаковую первичную структуру и по 141 аминокислотному остатку. Две другие, обозначаемые β-цепями, также идентично построены и содержат по 146 аминокислотных остатков. Таким образом, вся молекула белковой части гемоглобина состоит из 574 аминокислот. Во многих положениях α- и β-цепи содержат разные аминокислотные последовательности, хотя и имеют почти одинаковые пространственные структуры. Получены доказательства, что в структуре гемоглобинов более 20 видов животных 9 аминокислот в последовательности оказались одинаковыми, консервативными (инвариантными), определяющими функции гемоглобинов; некоторые из них находятся вблизи гема, в составе участка связывания с кислородом, другие–в составе неполярной внутренней структуры глобулы.

В дополнение к основному гемоглобину HbA1 в крови взрослого человека доказано существование мигрирующего с меньшей скоростью при электрофорезе гемоглобина НbА2, также состоящего из 4 субъединиц: двух α-цепей и двух δ-цепей. На долю НbА2 приходится около 2,5% от всего гемоглобина. Известен, кроме того, фетальный гемоглобин (гемоглобин новорожденных), обозначаемый HbF и состоящий из двух α-цепей и двух γ-цепей. Фетальный гемоглобин отличается от HbA1 не только составом аминокислот, но и физико-химическими свойствами: спектральным показателем, электрофоретической подвижностью, устойчивостью к щелочной денатурации и др. Кровь новорожденного содержит до 80% HbF, но к концу 1-го года жизни он почти целиком заменяется на НbА (все же в крови взрослого человека открывается до 1,5% HbF от общего количества гемоглобина). Последовательность аминокислот в γ- и δ-цепях гемоглобинов окончательно не расшифрована.

Установление первичной структуры субъединиц молекулы гемоглобина стимулировало исследования по расшифровке структуры так называемых аномальных гемоглобинов. В крови человека в общей сложности открыто около 150 различных типов мутантных гемоглобинов. Появляются мутантные формы гемоглобинов в крови вследствие мутации генов. Обычно мутации делят на 3 класса в соответствии с топографией измененного участка молекулы. Если замена аминокислоты происходит на поверхности молекулы гемоглобина, то это мутация первого класса; подобные мутации обычно не сопровождаются развитием тяжелой патологии, и болезнь протекает бессимптомно; исключение составляет серповидно-клеточная анемия. При замене аминокислоты вблизи гема нарушается связывание

81

кислорода–это мутация второго класса, сопровождающаяся развитием болезни. И наконец, если замена происходит во внутреннем участке молекулы гемоглобина, говорят о третьем классе мутации; подобные мутации приводят к нарушению пространственной структуры и соответственно функции гемоглобина.

Аномальные гемоглобины, различающиеся по форме, химическому составу и величине заряда, были выделены при помощи электрофореза и хроматографии. Передающиеся по наследству изменения чаще всего являются результатом мутации единственного триплета, приводящей к замене одной какой-либо аминокислоты в полипептидных цепях молекулы гемоглобина на другую. В большинстве случаев происходит замена кислой аминокислоты на основную или нейтральную (табл. 2.1). Поскольку это замещение осуществляется в обеих полипептидных цепях одной из пар (α или β), образовавшийся аномальный гемоглобин будет отличаться от нормального величиной заряда и соответственно электрофоретической подвижностью.

Таблица 2.1. Замены аминокислот в аномальных гемоглобинах человека

В табл. 2.1 представлены некоторые типы аномальных гемоглобинов, составы их полипептидных цепей с указанием известной или вероятной локализации замены либо в α-, либо в β-цепях. Замены необычной аминокислотой в аномальных гемоглобинах имеют место как в α-, так и в β-цепях. Исключение составляет гемоглобин Н, все 4 полипептида которого представлены β-цепями, идентичными по структуре β-цепям нормального гемоглобина A1.

Следует указать, что некоторые мутации, вызывающие существенное изменение структуры и соответственно функции гемоглобина, оказываются летальными, и индивидуумы с подобным гемоглобином умирают в раннем возрасте. Однако при ряде мутаций замена аминокислот не вызывает заметного изменения функции гемоглобина, в этих случаях болезнь протекает бессимптомно.

Болезни гемоглобинов (их насчитывают более 200) называют гемоглобинозами. Принято делить их на гемоглобинопатии, в основе развития которых лежит наследственное изменение структуры какой-либо цепи

82

Рис. 2.2. Нормальные и серповидные эритроциты.

нормального гемоглобина (часто их относят также к «молекулярным болезням»), и талассемии, обусловленные наследственным нарушением синтеза какой-либо нормальной цепи гемоглобина. Различают также железодефицитные анемии.

Классическим примером наследственной гемоглобинопатии является серповидно - клеточная анемия, широко распространенная в странах Южной Америки, Африки и Юго-Восточной Азии. При этой патологии эритроциты в условиях низкого парциального давления кислорода принимают форму серпа (рис. 2.2). Гемоглобин S, как показали Л. Полинг и др., отличается рядом свойств от нормального гемоглобина: в частности, после отдачи кислорода в тканях он превращается в плохо растворимую дез- окси-форму и начинает выпадать в осадок в виде веретенообразных кристаллоидов, названных тактоидами. Последние деформируют клетку и приводят к массивному гемолизу. Болезнь протекает остро, и дети, гомозиготные по мутантному гену, часто умирают в раннем возрасте.

Химический дефект при серповидно-клеточной анемии был раскрыт В. Ингремом и сводится к замене единственной аминокислоты, а именно глутаминовой, в 6-м положении с N-конца на валин в β-цепях молекулы гемоглобина HbS (см. табл. 2.1, рис. 2.2). Это результат мутации в молекуле ДНК, кодирующей синтез β-цепи гемоглобина. Все остальные аминокислоты располагаются в той же последовательности и в таком же количестве, как и в нормальном гемоглобине НЬА:

Одной этой замены оказалось достаточно не только для нарушения формы эритроцита, но и для развития тяжелой наследственной болез- ни–серповидно-клеточнойанемии.

Талассемии, строго говоря, не являются гемоглобинопатиями. Это генетически обусловленное нарушение синтеза одной из нормальных цепей гемоглобина. Если угнетается синтез β-цепей, то развивается β-талас-

83

семия; при генетическом дефекте синтеза α-цепей развивается α-талас- семия. При β-талассемии в крови наряду с HbA1 появляется до 15% НЬА2 и резко повышается содержание HbF–до 15–60%. Болезнь характеризуется гиперплазией и разрушением костного мозга, поражением печени, селезенки, деформацией черепа и сопровождается тяжелой гемолитической анемией. Эритроциты при талассемии приобретают мишеневидную форму. Механизм изменения формы эритроцитов объяснить пока не удалось.

В медицинской практике часто проводят анализ кровяных пигментов, который основан на исследовании спектроскопических свойств гема гемоглобина, точнее продуктов его окисления (хлорида гемина и гематина, образующихся соответственно при обработке гемоглобина уксусной кислотой в присутствии хлорида натрия или разведенными растворами щелочей). При восстановлении гематина сульфитом аммония в присутствии глобина образуется производное гемоглобина–гемохромоген, в котором денатурированный глобин соединен с гемом. Полученный комплекс имеет характерный спектр поглощения. Этот метод широко применяется в судеб- но-медицинской практике при исследовании кровяных пятен.

Из многообразия производных гемоглобина, представляющих несомненный интерес для врача, следует прежде всего указать на оксигемоглобин НbО2 – соединение молекулярного кислорода с гемоглобином. Кислород присоединяется к каждому гему молекулы гемоглобина при помощи координационных связей железа, причем присоединение одной молекулы кислорода к тетрамеру облегчает присоединение второй молекулы, затем третьей и т.д. Поэтому кривая насыщения гемоглобина кислородом имеет сигмоидную форму, свидетельствующую о кооперативности связывания кислорода. Эта кооперативность обеспечивает не только связывание максимального количества кислорода в легких, но и освобождение кислорода в периферических тканях; этому способствует также наличие Н+ и СО

втканях с интенсивным обменом. В свою очередь кислород ускоряет2

высвобождение СО2 и Н+ в легочной ткани. Эта аллостерическая зависимость между присоединением Н+, О2 и СО2 получила название эффекта Бора.

Помимо кислорода, гемоглобин легко соединяется с другими газами,

вчастности с СО, NO и др. Так, при отравлении оксидом углерода

гемоглобин прочно с ним связывается с образованием карбоксигемоглобина (НbСО). При этом вследствие высокого сродства к СО гемоглобин теряет способность связывать кислород и наступает смерть от удушья, недостаточного снабжения тканей кислородом. Однако при быстром повышении парциального давления кислорода во вдыхаемом воздухе можно добиться частичного вытеснения СО из связи с гемоглобином и предотвратить летальный исход.

При отравлении оксидами азота, парами нитробензола и другими соединениями часть гемоглобина окисляется в метгемоглобин (НbОН), содержащий трехвалентное железо. Метгемоглобин также теряет способность к переносу кислорода от легких к тканям, поэтому при метгемоглобинемии (вследствие отравления окислителями) в зависимости от степени отравления может наступить смерть от недостатка кислорода. Если вовремя оказать помощь, т.е. повысить парциальное давление кислорода (вдыхание чистого кислорода), то и в этом случае можно вывести больного из опасного состояния.

Следует отметить, что самым надежным методом качественного определения различных производных гемоглобина является исследование их спектров поглощения.

84

У беспозвоночных роль переносчика кислорода часто выполняют пигменты негеминовой природы–гемэритрин и гемоцианин. Они не относятся к гемсодержащим хромопротеинам, хотя в их названиях содержится корень «гем». Эти белки, как и гемоглобин, несмотря на то что выполняют одну

иту же функцию, сильно различаются между собой по молекулярной массе

ичетвертичной структуре, химической природе активного центра, характеру связывания железа (гемэритрин) и меди (гемоцианин) с кислородом и др. (табл. 2.2).

Таблица 2.2. Некоторые свойства белков-переносчиков кислорода (по Г. Эйхгорну)

Трансферрины (сидерофилины)–группа сложных белков, полученных из разных источников и характеризующихся способностью специфично, прочно и обратимо связывать ионы железа Fe (III) и других переходных металлов. Наиболее подробно из этой группы белков изучен трансферрин сыворотки крови. Функция трансферрина заключается в транспорте ионов железа в ретикулоциты, в которых осуществляется биосинтез гемоглобина. Система трансферрин–ретикулоцит считается весьма перспективной для изучения взаимодействия металла с белком и белковой молекулы с клеткой.

Флавопротеины

Флавопротеины содержат прочно связанные с белком простетические группы, представленные изоаллоксазиновыми производными–окисленными флавинмононуклеотидом (ФМН) и флавинадениндинуклеотидом (ФАД). Флавопротеины входят в состав оксидоредуктаз – ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные реакции в клетке. Некоторые Флавопротеины содержат ионы металлов. Типичными представителями флавопротеинов, содержащих также негемовое железо, являются ксантиноксидаза, альдегидоксидаза, СДГ, дигидрооротатдегидрогеназа, ацил- КоА-дегидрогеназа и транспортирующий электроны флавопротеин. На долю двух последних приходится до 80% митохондриальных флавопро-

85

теинов, выполняющих важную роль в биоэнергетике клетки (см. главу 9). Негемовое железо связывается с белковым компонентом, отличающимся от гемсодержащих хромопротеинов. Железо ковалентно связано с атомом серы остатка цистеина в белке. При кислотном гидролизе такого белка освобождается железо и H2S. Несмотря на структурные отличия от цитохромов, негемовые флавопротеины выполняют аналогичную функцию в транспорте электронов благодаря способности переходить из окисленного в восстановленное состояние.

НУКЛЕОПРОТЕИНЫ

Нуклеопротеины состоят из белков и нуклеиновых кислот. Последние рассматриваются как простетические группы. В природе обнаружено 2 типа нуклеопротеинов, отличающихся друг от друга по составу, размерам и физико-химическим свойствам,– дезоксирибонуклеопротеины (ДНП) и рибонуклеопротеины (РНП). Названия нуклеопротеинов отражают только природу углеводного компонента (пентозы), входящего в состав нуклеиновых кислот. У РНП углевод представлен рибозой, у ДНП–дезоксирибозой. Термин «нуклеопротеины» связан с названием ядра клетки, однако ДНП и РНП содержатся и в других субклеточных структурах. Следовательно, речь идет о химически индивидуальном классе органических веществ, имеющих своеобразные состав, структуру и функции независимо от локализации в клетке. Доказано, что ДНП преимущественно локализованы в ядре, а РНП–в цитоплазме. В то же время ДНП открыты в митохондриях, а в ядрах и ядрышках обнаружены также высокомолекулярные РНП.

Пристальное внимание исследователей привлечено к структуре и функции макромолекул, включающих комплексы белков и нуклеиновых кислот. Этот особый интерес вызван тем, что многообразие проявлений жизни непосредственно связано с этими полимерными молекулами. Биохимики имеют достаточно оснований для утверждения, что природа синтезированных в клетках белков зависит в первую очередь от природы ДНП, точнее ДНК, а свойства живых организмов, как и структурная организация субклеточных органелл, клеток и целостного организма, определяются свойствами синтезированных белков.

ДНК хранит наследственную информацию. Подтверждением этого служит явление трансформации, наблюдаемое у бактерий и открытое также в культуре клеток человека. Сущность явления заключается в превращении одного генетического типа клеток в другой путем изменения природы ДНК. Так, удалось получить штамм капсулированных и вирулентных пневмококков из исходного штамма, не обладающего этими признаками, путем внесения в среду ДНК, выделенной из капсулированного (и вирулентного) штамма. С нуклеопротеинами и соответственно нуклеиновыми кислотами непосредственно связаны, кроме того, такие биологические процессы, как митоз, мейоз, эмбриональный и злокачественный рост и др.

У большинства клеток эукариот, когда ядро находится в интерфазе, из ДНК и белковых молекул образуются так называемые филаменты–нити, имеющие меняющуюся толщину (в среднем около 10 нм, реже 2 нм). Оказывается, что толщина филаментов определяется наличием или отсутствием белков, окружающих двухспиральную структуру ДНК, а длина их–молекулярной массой ДНК. Известно, что одна хромосома содержит одну молекулу ДНК, имеющую длину несколько сантиметров. Вообще ДНП входит в состав мононуклеосом, являющихся составной частью

86

а

б

Рис. 2.3. Модель вируса мозаичной болезни табака, а- спираль РНК; б- субъединицы белка.

хромосомы. Таким образом, в состав хроматина входят молекула ДНК, пять различных классов белков–гистонов и так называемые негистоновые белки. Количество ДНК в ядре составляет до 6 пг (10–12 г) на одну клетку у животных. У E.coli содержание ДНК равно 0,01 пг.

Относительно белкового состава ДНП известно, что все 5 классов гистонов различаются по размерам, аминокислотному составу и величине заряда (всегда положительный). Так, выделяют гистоны, богатые лизином (H1), молекулярная масса которых составляет в среднем 20000, и богатые аргинином с мол. массой до 15000. Они обозначаются следующими символами:

H1 – богатые лизином,

Н2А–богатые аргинином и лизином, Н2В–умеренно богатые аргинином и лизином, Н3–богатые аргинином, Н4–богатые глицином и аргинином.

Природа негистоновых белков пока не достаточно выяснена. Негистоновые белки в настоящее время интенсивно изучаются. В их состав входят сложные белки, ферменты, а также регуляторные белки. По своим свойствам последние отличаются от гистонов и представлены кислыми белками.

В различных нуклеопротеинах количество нуклеиновой кислоты колеблется от 40 до 65% (например, в рибосомах про- и эукариот). В вирусных нуклеопротеинах количество нуклеиновых кислот не превышает 2–5% от общей массы. Так, у вируса табачной мозаики (ВТМ) на долю РНК*, правда, с огромной молекулярной массой–около 2000000, приходится всего около 2%. Остальная часть этой гигантской вирусной частицы приходится на долю однотипных белковых субъединиц (рис. 2.3). Ионная связь между РНК и белковыми молекулами ВТМ весьма непрочная и легко разрывается даже в «мягких» условиях, что позволяет отделить РНК от белка. Интересно, что после удаления разрывающего ионную связь агента при смешивании этих продуктов происходят полная регенерация исходного ВТМ, восстановление всех его физических параметров и биологических свойств, включая способность поражать зеленый лист. Это явление самосборки, впервые открытое у ВТМ, в дальнейшем было обнаружено также у бактериофагов, представленных нуклеопротеинами. Акад. А.С. Спирин и одновременно

М.Номура разделили 70S рибосомы (рибонуклеопротеины) на их состав-

*Растительные вирусы чаще всего содержат РНК, а вирусы, поражающие клетки животных, содержат как РНК (вирус саркомы Рауса и др.), так и ДНК (вирус папилломы). Бактериофаги также содержат РНК или ДНК в комплексе с белками.

87

ляющие и разработали условия для самосборки полноценных функционирующих рибосом. В основе этого удивительного явления самосборки лежит, по-видимому, программа, содержащаяся в первичной структуре как белка, так и нуклеиновой кислоты и определяющая, какое количество белковых молекул и в какой последовательности должно присоединиться к единственной молекуле РНК (в случае ВТМ) или к 3 молекулам РНК (в рибосомах), чтобы обеспечить высокую точность реконструкции надмолекулярных структур.

В настоящее время и ядерный хроматин (ДНП), и рибосомы, и вирусные нуклеопротеиды обычно рассматривают именно как надмолекулярные комплексы или структуры, а отнесение этих образований в раздел «Сложные белки»–в значительной степени дань традиции.

ЛИПОПРОТЕИНЫ

В последние годы достигнут определенный прогресс в выяснении химической природы и структуры липопротеинов (ЛП). Этот класс сложных белков состоит из белка и простетической группы, представленной какимлибо липидом. В частности, в составе липопротеинов открыты нейтральные жиры, свободные жирные кислоты, фосфолипиды, холестериды. Липопротеины широко распространены в природе: в растениях, тканях животных и у микроорганизмов–и выполняют разнообразные биологические функции. Они входят в состав клеточной мембраны и внутриклеточных биомембран ядра, митохондрий, микросом (структурированные липопротеины), а также присутствуют в свободном состоянии (главным образом в плазме крови). К липопротеинам относятся, кроме того, тромбопластический белок ткани легких, липовителлин желтка куриного яйца, некоторые фосфолипиды молока и т.д. Установлено, что липопротеины участвуют в структурной, комплексной организации миелиновых оболочек, нервной ткани, хлоропластов, фоторецепторной и электронно-транспортной систем, палочек и колбочек сетчатки и др.

Большинство ЛП синтезируется в печени или в слизистой оболочке кишечника. Они содержат гидрофобное липидное ядро, окруженное полярными липидами и оболочкой из белков, получивших название апобелки. Различают 8 типов апобелков: апо-AI, АII, В, CI, СII, CIII, D и Е. Обычно ЛП содержат до 5% углеводов (глюкоза, галактоза, гексозамины, фукоза, сиаловая кислота), поэтому некоторые из них являются и гликопротеинами.

Липопротеины сыворотки крови подразделяют на отдельные классы в зависимости от электрофоретической подвижности (с белками крови) и от плотности при ультрацентрифугировании. Различают ЛП низкой плотности (ЛПНП), очень низкой плотности (ЛПОНП), высокой плотности (ЛПВП), очень высокой плотности (ЛПОВП) и ЛП промежуточной плотности (ЛППП) (табл. 2.3).

Функции и значение отдельных классов ЛП в развитии артерио- и атеросклероза подробно рассматриваются в главе 17.

Механизм связывания белкового компонента с липидами. Имеются данные, что в образовании липопротеинов участвуют нековалентные силы различной природы, определяемые наличием или отсутствием у липидного компонента ионизированных групп атомов. Если в образовании липопротеина участвуют фосфолипиды, то между ними и белковой молекулой возникает ионный тип связи (рис. 2.4).

Доказано также существование гидрофобных взаимодействий между неполярными группами липидного компонента (например, радикалы

88

Таблица 2.3. Классификация и основные свойства ЛП сыворотки крови человека

жирных кислот) и белковой молекулы. Чаще в липопротеинах действуют комбинированно разные нековалентные силы, способствуя образованию в высшей степени упорядоченной двойной белково-липидной структуры биомембран.

ФОСФОПРОТЕИНЫ

К белкам этого класса относятся казеиноген молока, в котором содержание фосфорной кислоты достигает 1%; вителлин, вителлинин и фосвитин, выделенные из желтка куриного яйца; овальбумин, открытый в белке куриного яйца; ихтулин, содержащийся в икре рыб, и др. Большое количество фосфопротеинов содержится в клетках ЦНС. Фосфопротеины занимают особое положение в биохимии фосфорсодержащих соединений не только в результате своеобразия структурной организации, но и вследствие широкого диапазона функций в метаболизме. Характерной особенностью структуры фосфопротеинов является то, что фосфорная кислота оказывается связанной сложноэфирной связью с белковой молекулой через

Рис. 2.4. Ионный тип связи между белками и фосфолипидами.

89

гидроксильные группы β-оксиаминокислот, главным образом серина и в меньшей степени треонина. На одну молекулу белка обычно приходится 2–4 остатка фосфата.

Новые данные свидетельствуют о том, что в клетках фосфопротеины синтезируются в результате посттрансляционной модификации, подвергаясь фосфорилированию при участии протеинкиназ. Этот процесс подробно рассматривается в главе 14. Здесь лишь укажем на существенную роль специфической протеинкиназы, катализирующей фосфорилирование ОН-группы тирозина, в биосинтезе онкобелков. Таким образом, уровень фосфопротеинов в клетке зависит в значительной степени от регулирующего действия ферментов, катализирующих фосфорилирование (протеинкиназы) и дефосфорилирование (протеинфосфатазы). Следует отметить, что фосфопротеины содержат органически связанный, лабильный фосфат, абсолютно необходимый для выполнения клеткой ряда биологических функций. Кроме того, они являются ценным источником энергетического и пластического материала в процессе эмбриогенеза и дальнейшего постнатального роста и развития организма.

Особо следует отметить, что некоторые ключевые ферменты, регулирующие процессы внутриклеточного обмена веществ, также существуют как в фосфорилированной, так и в дефосфорилированной форме. Этим подчеркивается значение фосфорилирования–дефосфорилирования в процессах химической модификации макромолекул, участвующих в интегральных процессах метаболизма.

ГЛИКОПРОТЕИНЫ

Гликопротеины–сложные белки, содержащие, помимо простого белка или пептида, группу гетероолигосахаридов. В настоящее время их принято называть г л и к о к о н ъ ю г а т а м и . В состав гликоконъюгата входит углеводный компонент (гликановая фракция), ковалентно связанный с неуглеводной частью (агликановая фракция), представленной белком, пептидом, аминокислотой или липидом.

Повышенный интерес к науке об углеводах–гликобиологии–в настоящее время объясняется открытием существенной роли изменений структуры гликоконъюгатов в развитии таких болезней, как рак, иммунодефицит человека, ревматоидные артриты, астма и др. Оказалось, что нарушение реакции гликозилирования (см. главу 14) двух главных классов гликоконъюгатов (гликопротеинов и ганглиозидов) приводит или к накоплению предшественников этих веществ, или к синтезу «укороченных» сахарных цепей гликоконъюгатов. Более того, установлено, что во взаимодействии между некоторыми вирусами и клетками-мишенями главную роль играют углеводные компоненты. В частности, гликопротеин gp120 вируса иммунодефицита человека (содержит большой процент углевода) имеет высокое

90