Этапы цитогенетического метода:

• подбор клеточного материала,

• культивирование соматических клеток на искусственных питательных средах (клетки человека быстро размножаются на питательных средах)

• добавление ФГА - фитогемагглютинина – стимулятора митоза,

• добавление колхицина – мутагена разрушающего веретено деления во время митоза, для остановки митоза на стадии метафазы

• обработка клеток гипотоническим раствором, вследствие хромосомы набухают, рассыпаются и лежат свободно

• окрашивание хромосом

• изучение под микроскопом, фотографирование

• вырезание и построение идеограммы

Основные сведения о морфологии хромосом человека получены при изучении их в метафазах митоза прометафазе-метафазе мейоза. При этом важно, чтобы количество делящихся клеток, было достаточно велико.

Подбор клеточного материала. Культивирование

Препараты хромосом можно приготовить из всех тканей и клеточных суспензий, содержащих делящиеся клетки. У человека в большинстве случаев используют препараты из клеток костного мозга, кратковременной культуры крови или из длительной культуры фибробластов кожи. Используют биоптаты семенников, слущенные эмбриональные клетки плода (аминиоцентез), плацетобиопсия (биопсия плода – хорионбиопсия и плаценты).

Наиболее простым и доступным методом является культивирование клеток крови. Пункция костного мозга или биопсия кожи для культивирования фибробластов технически сложнее, и к тому же аспирация костного мозга – весьма неприятная процедура. Препараты из костного мозга имеют, однако, то преимущество, что дают возможность изучать митозы invivo, вне культуры клеток, а сразу после взятия материала у пациента.

В крови здоровых людей нет делящихся клеток. Однако митоз этих клеток можно стимулировать искусственно, обработав их стимулятором митоза фитогемагглютинином ФГА. Берут один миллилитр периферической крови. Суспензию лейкоцитов выращивают в культуральной среде invitro72 часа и затем готовят препараты хромосом. Чтобы остановить клетки в прометафазе, подавляют образование веретена деления веществами с колхицином. Для свободного распределения хромосом в плоскости препарата клетки обрабатывают гипотоническим раствором. Затем каплю суспензии наносят на стекло и окрашивают.

Окрашивание.

Наиболее простой способ окрашивания – простая рутинная сплошная по всей длине хромосомы основным (щелочным) красителем Гимза или 2% - ным ацетоорсеином или ацеткармином. Эти красители окрашивают хромосомы целиком, равномерно и интенсивно.Для выявления численных аномалий хромосом этот метод вполне достаточен.

Для получения более детальной картины структуры хромосом или их сегментов используют различные способы дифференциального окрашивания. Методы дифференциальной окраски хромосом основаны на действии солевых растворов с определённым Ph, температурным режимом, обработкой ферментами протеазами. Этими методами установлена четкая структурная разнородность хромосом по длине на красящиеся (тёмные - гетерохроматин) и некрасящиеся (светлые - эухроматин) полосы. Дифференциальное окрашивание приводит к появлению линейного рисунка по длине хромосомы. Окрашивание может охватывать отдельные районы. Рисунок этих полос специфичен, индивидуален для каждой пары хромосом. Рисунок сегментации зависит от особенностей неоднородности целостного комплекса ДНК – белок в разных участках по длине хромосом.

Различные типы сегментов обозначают по методам, с помощью которых они выявляются наиболее отчетливо.