Занятие 16

Лабораторная работа. Определение концентрации липопротеидов высокой и низкой плотности в сыворотке (плазме) крови.

Принцип метода. Хиломикроны, липопротеиды очень низкой плотности (VLDL) и липопротеиды низкой плотности (LDL) осаждаются при добавлении к образцу фосфорновольфрамовой кислоты и Мg²⁺. После центрифугирования в супернатанте остаются только липоротеиды высокой плотности (НDL).

Ход работы.

Реагенты	Опытная проба, мл	Стандартная проба, мл
Сыворотка (плазма)	0,15	-
Осаждающий реагент	0,3	0,3
Стандартный раствор	-	0,15

Хорошо перемешать и оставить на 10 мин. при комнатной температуре. Опытную пробу отцентрифугировать в течение 10 мин. при 4 000 об./мин. Прозрачный супернатант используют для определения концентрации НDL. Определить холестерин в опытной и стандартной пробах в течение часа.

Реагенты	Опытная проба, мл	Стандартная проба, мл
Супернатант	0,2	-
Рабочий реагент	2,0	2,0
Стандартный раствор + осаждающий реагент	-	0,2

Реакционную смесь тщательно перемешивают и инкубируют не менее 10 минут при комнатной температуре (18-25⁰С) и измеряют оптическую плотность опытной и стандартной проб против дистиллированной воды в кюветах с толщиной поглощающего слоя 5мм при длине волны 490нм. Окраска стабильна не менее 2 часов после окончания инкубации при предохранении от прямого солнечного света.

Примечание. Для анализа использовать только прозрачный супернатант. В случае мутного супернатанта (неполное осаждение) или при содержании триглицеридов в пробе более 4,0 ммоль/л следует провести повторное осаждение, увеличив объём осаждающего реагента в 2 раза. Полученный результат умножить на 2.

Расчёт концентрации (С) холестерина НDL проводят по формуле:

С = Еоп./Ест. • 1,29 (ммоль/л) или С = Еоп./Ест. • 50 (мг/100мл)

где Е_оп. – экстинкция опытной пробы,

Е_ст. – экстинкция стандартной пробы,

Расчёт концентрации (С) LDL проводят по формуле:

С = [общий холестерин] – [НDLхолестерин] – [триглицериды/5] мг/100 мл или С = [общий холестерин] – [НDLхолестерин] – [триглицериды/2,2] ммоль/л

Норма. НDL

Мужчины Женщины

Нормальные величины: > 55 мг/100мл > 65 мг/100мл

(1,42ммоль/л) (1,68ммоль/л)

Группа риска: 35-55 мг/100мл 45-65 мг/100мл

(0,9-1,42ммоль/л) (1,16-1,68ммоль/л)

Патологическое нарушение липидного обмена:

<35 мг/100мл <45 мг/100мл

(0,9ммоль/л) (1,16ммоль/л)

LDL

Группа риска: ≥150 мг/100мл ≥190 мг/100мл

(3,9ммоль/л) (4,9 ммоль/л)

Клинико-диагностическое значение.