Инструкция "использование реакции непрямой гемагглютинации для выявления антител при менингококковой инфекции"

Глава 1

ПОКАЗАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) с менингококковым эритроцитарными диагностикумами серогрупп A, B и C проводят в следующих случаях:

а) как дополнительный метод диагностики менингококковой инфекции. Обязательным требованием является исследование сывороток крови от больных, взятых в разные сроки от начала заболевания, т.е. в динамике. Оптимальным вариантом является обследование всех лиц (скрининг) с подозрением на генерализованные формы менингококковой инфекции (ГФМИ), что позволит существенно увеличить процент лабораторного подтверждения ГФМИ (у взрослых - до 80%, у детей - до 60% случаев);

б) для ретроспективного выявления локализованных форм менингококковой инфекции в очагах заболевания;

в) при проведении иммуноэпидемиологических исследований среди населения с целью определения серонегативных контингентов;

г) при оценке иммунологической эффективности противоменингококковой вакцинации.

Глава 2

МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

(РНГА) С ЭРИТРОЦИТАРНЫМИ МЕНИНГОКОККОВЫМИ ДИАГНОСТИКУМАМИ

Реакцию непрямой гемагглютинации можно поставить как макро-, так и микрометодом, причем в последнем случае используют только микротитраторы "Такачи".

Различия между этими методами заключаются лишь в объемах используемых ингредиентов и сроках учета результатов реакции. При макрометоде реагирующая смесь в каждой лунке состоит из 0,5 мл соответствующего разведения сыворотки крови и 0,25 мл диагностикума. В микрометоде объемы соответственно уменьшаются: 0,05 мл сыворотки и 0,025 мл диагностикума.

Учет результатов исследования в микротитраторе проводят спустя 2 часа инкубации в термостате; при макрометоде иногда требуется дополнительная экспозиция в течение 1 - 2 часов при комнатной температуре.

2.1. Необходимые реагенты и приборы:

- эритроцитарные менингококковые серогруппы A, B и C диагностикумы;

- сыворотки диагностические менингококковые группоспецифические A, B и C;

- нормальная кроличья сыворотка, сухая кроличья плазма или бычий сывороточный альбумин;

- исследуемый материал (сыворотка крови человека);

- полистироловые пластины с лунками, серологические пробирки или микротитраторы с V-образными лунками (системы "Такачи");

- термостат для поддержания температуры 37 град. C;

- водяная баня для поддержания температуры 56 град. C;

- потенциометр для измерения pH-растворов;

- пипетки стеклянные мерные;

- дозаторы пипеточные П1 на 0,5; 0,05;

- хлорид натрия (NaCl);

- натрий фосфорно-кислый двузамещенный (Na2HPO4 X 12H20);

- калий форсфорно-кислый однозамещенный (КН2РО4);

- дистиллированная вода.

2.2. Подготовка ингредиентов.

2.2.1. Приготовление исходного забуферного физиологического раствора pH 7,2 (ЗФР).

В 0,5 л дистиллированной воды растворяют: хлорида натрия (NaCl) - 8,65 г, натрия фосфорно-кислого двузамещенного (Na2HP04 x 12Н20) - 1,92 г, калий форсфорно-кислый однозамещенный (КН2РО4) - 0,44 г.

Объем раствора доводят до 1 л дистиллированной водой. После растворения солей проверяют pH раствора, который должен быть равен 7,2. Раствор фильтруют через бумажный фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при 0,5 атм. 30 минут.

ЗФР необходим для приготовления стабилизирующего буфера, в котором проводят титрование исследуемых сывороток крови.

2.2.2. Стабилизирующий буфер.

В качестве стабилизатора можно применять нормальную кроличью сыворотку (НКС), сухую кроличью плазму или бычий сывороточный альбумин (БСА).

Используемая НКС не должна давать неспецифической (спонтанной) реакции гемагглютинации с эритроцитарными диагностикумами. Инактивированную при +56 град. C в течение 30 минут НКС или плазму добавляют к ЗФР из расчета 1,0 мл на 100,0 мл (получают 1% раствор), БСА не инактивируют. Концентрация БСА в ЗФР - 0,5%.

2.2.3. Взятие крови.

Для проведения серологических исследований кровь от больных ГФМИ или с подозрением на эту инфекцию забирают из локтевой вены с соблюдением обычных правил асептики; при массовых серологических исследованиях кровь берут из пальца.

После образования сгустка, полученную сыворотку отсасывают стерильной пипеткой в стерильную посуду (пробирки, ампулы). Хранят сыворотку крови в холодильнике при +4 град. C. В реакции исследуют сыворотки крови без признаков пророста.

Перед постановкой РНГА сыворотки разводят 1:5 исходным буфером (ЗФР). Титрование сывороток крови проводят в стабилизирующем буфере.