Джефферсон - Сборник упражнений и задач - 2000 / Student Guide24

Прогулка по главе

Новые технологии и ферменты рестрикции

Методы манипуляции с ДНК позволили осуществить ……………………(1) индивидуальных генов, определение нуклеотидных ………………(2) и работу с ними, а также перенос генов от одного …….……………..(3) к другому. Кроме того, коды ДНК могут быть прочитаны для дедуктивного определения последовательности ………………...(4). Без разработки новейших технологий решение таких задач на огромном количестве материала нуклеиновой кислоты, отличающимся только по ……………………….(5), было проблематично. Рестрикционные эндонуклеазы, называемые также ДНКазами или ферментами ……………..(6), - это ферменты ……………(7). Они разрезают ДНК в точно определенных участках нуклеотидной последовательности. Разрезаемая последовательность обладает двойной симметрией, так что …………….(8) цепь, читаемая в направлении 5′ → 3′, имеет …………………..(9) последовательность. Биологическая функция этих …………(10), очевидно, состоит в ………..(11) клетки от проникновения чужеродной ДНК. Клетка защищает собственную ДНК от разрезания рестриктазами путем присоединения

…………..(12) группы к одному из оснований во всех ……………..(13) последовательностях. Разные штаммы бактерий имеют ……………(14) рестрикции с различными сайтами

……….………….(15).

Ответы: (1) выделение; (2) последовательностей; (3) вида; (4) белка; (5) последовательности; (6) рестрикции; (7) бактерий; (8) комплементарная; (9) идентичную; (10) эндонуклеаз; (11) защите; (12) метильной; (13) узнаваемых; (14) ферменты; (15) узнавания.

Клонирование

При клонировании генома получают фрагмент ………….(1) с последовательностью оснований, идентичной соответствующему сегменту ДНК. Выделяемая кДНК, [“к” означает ………………(2)],

является двухцепочечной копией ДНК, синтезированной на ……………(3). Она отличается от нативной ДНК тем, что не содержит ……………..(4). Обратите внимание, что клонированные эукариотические гены ……….………(5) управлять синтезом собственного белка в ……………..(6), однако эта кДНК может быть транскрибирована в ……………..(7) при условии, что соответствующие сигналы …………….(8) находятся на своих местах. Этот модифицированный транскрипт будет управлять ………………(9) белка в бактериях. При клонировании для

……………….(10) единственного фрагмента ДНК обычно используется бактериальная клетка, а, поскольку, бактериальные клетки обладают способностью быстро воспроизводить собственные точные копии, то использование чистых …………….(11) отобранных клеточных ………..(12) позволяет получать копии специфических фрагментов ДНК поистине в ……………(13)

количествах. Клонирующие ……………….(14) представляют собой молекулы ДНК, полученные путем объединения фрагментов ДНК из одного источника, с ДНК, способной к …………….(15) в клетках E.coli. ДНК бактериофага λ можно…………….(16) фрагмент ДНК человека размером около ……………….(17) т.п.о., в результате чего создается ………………(18) фаг. Такие рекомбинантные молекулы ДНК получают из выбранных фрагментов ДНК путем соединения их

……………….(19), образующихся при разрезании рестриктазами, которые формируют

…………….(20) последовательности оснований, способные к самопроизвольному спариванию друг с другом. Фрагменты ДНК, имеющие идентичные липкие концы, будут соединяться вместе. Для “запечатывания” разрывов цепи ДНК используется ……………….(21) фермент. Вектор может быть упакован в ДНК фага λ и использован для ……………..(22) клеток E.coli c применением процедуры, резко повышающей вероятность того, что только .………..(23) фаг проникнет в данную клетку. Используемый штамм E.coli должен быть …………….(24), у которого отсутствует собственный фермент рестрикции. В том случае, когда в генно-инженерной работе используется много различных фрагментов ДНК, создается геномная ……………..(25), в которой полностью фрагментированный ………………(26) может быть целиком представлен в ………….(27)

различных клеток E.coli, в количестве одного фрагмента на клетку. Инфицированные фагом клетки растут в виде …………..(28), и их можно отличить от неинфицированных клеток.

Ответы: (1) ДНК; (2) комплементарная; (3) мРНК; (4) интроны; (5) не могут; (6) бактериях; (7) мРНК; (8) транскрипции; (9) синтезом; (10) репликации; (11) культур; (12) линий; (13) неограниченных; (14) векторы; (15) репликации; (16) встроить; (17) 15-20; (18) рекомбинантный; (19) липких концов; (20) выступающие; (21) лигирующий; (22) инфицирования; (23) один; (24) мутантом; (25) библиотека; (26) геном; (27) культуре; (28) бляшек.

Заполните следующее

Скрининг библиотеки

Далее бляшки подвергаются ………………………..(1) с использованием ………………(2) зонда, содержащего короткий (» 20 нуклеотидов) фрагмент ДНК, последовательность оснований которого комплементарна известной последовательности в исследуемом гене. Эта процедура включает

……………….(3) фаговой частицы из каждой …….…………(4) на кусочек мембраны, связывающей ДНК. После ряда этапов обработки мембраны …………………(5) гибридизационный зонд используется для идентификации бляшки, содержащей интересующий фрагмент ДНК. Радиоактивность применяется с целью …………………(6), поскольку она может быть определена на листе ………………(7) пленки. Из выбранной и идентифицированной бляшки может быть выращено неограниченное число фаговых частиц путем инфицирования дополнительного количества клеток E.coli. ДНК-………….(8) может быть получен синтетическим путем, идя в

………………(9) от аминокислотной ……………..(10) кодируемого белка. Принимая во внимание избыточность генетического кода стоит приготовить несколько зондов. Библиотека ……………(11)

человека создается путем выделения ………….(12) из клеток, экспрессирующих искомый ген.

Почти все мРНК клеток человека имеют поли ……(13) хвост, который отсутствует у других форм РНК. Это обстоятельство положено в основу метода очистки мРНК, который предусматривает использование для фракционирования колонку, содержащую синтетический лиганд …………..(14), так что только мРНК ……………(15) с колонкой, а остальные типы РНК проходят через нее не задерживаясь. Далее мРНК элюируется с использованием раствора с низкой ионной силой и копируется в ДНК с помощью очищенной обратной ………………(16) вируса. После этого РНК разрушают, а одноцепочечную ДНК превращают в двухцепочечную с использованием свободной от экзонуклеазной активности ДНК- ………….(17). Наконец, ДНК встраивают в рекомбинантные

……………….(18), часто используя лигирование по тупым концам, и ............................. (19) в бактериях.

Ответы: (1) скринингу; (2) гибридизационного; (3) перенос; (4) бляшки; (5) радиоактивный; (6) идентификации; (7) фотографической; (8) зонд; (9) обратном направлении; (10) последовательности; (11) кДНК; (12) мРНК; (13) А; (14) олиго-dT; (15) связывается; (16) транскриптазы; (17) полимеразы; (18) векторы; (19) клонируют.

Плазмиды

ДНК, встроенная в фаг, может быть амплифицирована и легко выделена. Обычно полученную таким образом ДНК, встраивают в бактериальную …………….(1), которая, по сравнению с фагом намного меньше по размерам и проще регулируется. В зависимости от размера ДНК и целей эксперимента используются либо плазмиды для ……..…………….(2), либо …………………..(3) вектор. Экспрессирующие векторы имеют соответствующие сигналы транскрипции и трансляции, необходимые для синтеза …………….(4) в клетках E.coli. Плазмиды представляют собой

………………..(5) молекулы ДНК, которые могут размножаться в клетке. Клетки можно обработать и сделать их …………….………….(6) для поглощения плазмиды из буферного раствора. Плазмиды можно превратить в …………(7) молекулы путем их разрезания, встраивания кДНК и замыкания кольца. Плазмиды вводят в клетки E.coli таким образом, что только инфицируется небольшая популяция клеток и вероятность попадания двух плазмид в одну клетку минимальна. Субпопуляция клеток, несущих плазмиду, может быть отобрана с применением методики сходной с той, что была использована при ……………(8) плазмиды pBR322, имеющей гены устойчивости к

………………….(9) и …………….(10), с сайтами узнавания для различных ферментов

……………..(11) внутри каждого из этих генов. Поэтому, в зависимости от того, в какой участок плазмиды встроен фрагмент чужеродной ДНК, устойчивость клетки в отношении одного из этих

…………….(12) может ……………….(13). Рост нативных или диких штаммов E.coli угнетается обоими антибиотиками, тогда как бактерии с плазмидой будут ……………..(14) к обоим антибиотикам, а клетки с ……………..(15), содержащей встроенную кДНК, будут устойчивы только к ………….(16) антибиотику; последнее будет определяться тем, какой из генов устойчивости остался не нарушен. С помощью такого подхода могут быть ……………(17) соответствующие клетки.

Ответы: (1) плазмиду; (2) секвенирования; (3) экспрессирующий; (4) белка; (5) кольцевые; (6) компетентными; (7) рекомбинантные; (8) клонировании; (9) ампициллину; (10) тетрациклину; (11) рестрикции; (12) антибиотиков; (13) изменяться; (14) устойчивы; (15) плазмидой; (16) одному; (17) отобраны.

Секвенирование ДНК

Для секвенирования последовательности клонированных фрагментов ДНК используются два метода: прямой химический метод ……………(1) и основанный на ферментативной репликации ДНК ……………….(2) метод Сэнгера. Метод Сэнгера состоит в копировании ДНК, выбранной для секвенирования, при помощи фермента ................................(3). Для этой реакция необходимы четыре дезоксинуклеозид………..……..(4), одноцепочечный фрагмент ……………(5), выбранные для копирования, и ………………(6), который гибридизуется в стартовой точке. В реакционную смесь также вводят небольшие количества …………….(7) производного одного из нуклеозидтрифосфатов, ………………….(8). Буква “N” в NTP используется для обозначения одного из четырех оснований нуклеиновой кислоты. Ход реакции оценивают по включению ……………(9)

в молекулу. ……………..(10) метод, используемый для ……………….(11) синтезированных молекул ДНК, является достаточно чувствительным даже для фракционирования фрагментов, отличающихся по длине только на один нуклеотид. Цепь растет по мере того, как полимераза добавляет нуклеозид к ……………(12) группе предшествующего основания. Важный момент в этой методике, который делает возможным определение последовательности, заключается в том, что при добавлении дидезокси NTP, у которого ……………(13) 3′-OH группа, удлинение цепи

……………(14). Обратите внимание, что поскольку дидезокси NTP содержит ……………(15)

фосфатную группу, он может быть присоединен к (поли)нуклеотидной цепи, но следующее основание нет, поэтому последним нуклеотидом в последовательности является именно дидезоксинуклеотид. При использовании довольно …………..(16) количества единственного дидезокси NTP на каждой дорожке геля, большая часть синтезированных цепей будет содержать

……………….(17) основания, однако …………….(18) фракция будет иметь ……………….(19)

основание на концевом нуклеотиде. На электрофоретическом геле терминированные цепи определяются в виде отдельных …………….(20). Такая процедура повторяется для каждого из четырех используемых …………….(21) NTP, A, G, C и Т. Все четыре инкубационные пробы могут быть поставлены одновременно и продукты реакции, фракционируемые на соседних дорожках геля, образуют ………………..(22) лестницу. Последовательность читается снизу геля вверх и соответствует последовательности ……………….(23) цепи, синтезированной на матрице. В результате определяется ……………………….(24) новосинтезированной комплементарной цепи ДНК в 5′ → 3′ направлении. Последовательности исходной и новосинтезированной цепей комплементарны и антипараллельны. На каждом геле может быть определено около

…………….(25) оснований, поэтому для секвенирования очень больших фрагментов ДНК

используется стратегия перекрывающихся фрагментов. С целью определения кодируемой

………………(26) кислотной последовательности должна быть найдена правильная рамка

…………….(27).

Ответы: (1) Максама-Гилберта; (2) дидезокси-метод; (3) полимеразы; (4) трифосфата; (5) ДНК;

(6) праймер; (7) дидезокси; (8) ddNTPs; (9) радиоактивности; (10) Электрофоретический; (11) разделения; (12) 3′-OH; (13) отсутствует; (14) прекращается; (15) 5′; (16) небольшого; (17) обычные; (18) терминированная; (19) определенное; (20) полос; (21) дидезокси; (22) секвенирующую; (23) копии; (24) последовательность; (25) 200-300; (26) амино; (27) считывания.

Заполните следующее

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция, ……………….(1), - это метод …………………..(2) специфических фрагментов ДНК, для которого нужны ничтожно малые количествах исходной ДНК. Метод включает отбор фрагментов двуцепочечной ДНК, разделение цепей с помощью ……………..(3), копирование ДНК и ………………….(4) процесса снова и снова. Участок длинной последовательности ДНК копируется с использованием ……………….(5), соответствующих по последовательности границам подлежащего амплификации фрагмента. Для каждого конца ДНК требуются различные праймеры, так что иногда должна быть известна ........………(6) оснований ДНК, с которой будут ……………(7) праймеры. Степень амплификации ……………….(8),

поскольку каждая из исходных последовательностей и каждый из уже копированных фрагментов воспроизводятся в каждом цикле, приводя к ……………………(9) росту количества копий фрагментов ДНК. Одно из открытий, давших выход в практику этому методу, состояло в использовании ………….(10) ДНК-полимеразы из термофильных ………………(11).

Ответы: (1) ПЦР; (2) амплификации; (3) нагревания; (4) повторение; (5) праймеров; (6) последовательность; (7) гибридизоваться; (8) огромна; (9) экспоненциальному; (10) термостабильной; (11) бактерий.

Применение

Применение этих технологий включает использование бактериальных ……………..(1) векторов для получения ……………..(2) при экспрессии выделенных фрагментов кДНК. Это нашло широкое применение для получения белков человека, имеющих........……………..(3) ценность, которые трудно ……………….(4) непосредственно из природных источников [например,

………..………..(5)]. Другим преимуществом использования бактериальной системы экспрессии по сравнению с выделением белков из тканей человека является то, что синтез в клетках E.coli

………………….(6) опасность ……………………(7) целевого белка агентом …………………(8)

природы.Часто бактерии синтезируют так много белкового продукта, что он осаждается в виде телец ……………..(9). Собственный фолдинг белка в этом процессе часто …………….(10). Необходимость в .......……………(11), которое бактериальные клетки не осуществляют, может быть преодолена при использовании клеточных систем ………………..(12), например, насекомых.

Трансгенез заключается во встраивании …………….(13) в растительные или животные организмы, приводящем к проявлению различных ………………….(14) характеристик. Несмотря на то, что методы контроля встраивания специфической последовательности еще только разрабатываются одно из направлений исследования включает гено………………….(15). У

………………(16) использование клонирующих векторов и “метода дробовика” позволило успешно создать ………………..(17) к гербицидам организмы. Получены трансгенные животные, которые используются для различных целей. В одном случае заданный белок был экспрессирован в молоке животных. С помощью новых методов гены могут быть достаточно быстро проанализированы по определенным ………………(18) и точно локализованы. Например, гибридизация ……………(19) может быть использована для детекции ……………..(20) гена в очень малых образцах, как в случае …….………….(21). Метод, применяющийся для выявления таких последовательностей, называется блот-анализом по ……………..(22), и включает разрезание ДНК одним или несколькими ферментами рестрикции, разделение фрагментов на электрофоретическом геле и их ….……………(23) на мембрану со специфической радиоактивной гибридизационной пробой. Для некоторых заболеваний характерны определенные типы распределения полос. При использовании анализа ……………….(24) длины рестрикционных фрагментов (RFLP-анализ), повторяющиеся последовательности ДНК генома дают набор рестрикционных фрагментов, …………………(25) для каждого …………….(26). Поэтому RFLPанализ может быть использован как метод …………………(27) ДНК. Сравнительно недавно при проведении ……………..(28) реакции стала использоваться более чувствительная модификация этого метода.

Ответы: (1) экспрессирующих; (2) белка; (3) терапевтическую; (4) выделить; (5) инсулин; (6) устраняет; (7) загрязнения; (8) инфекционной; (9) включений; (10) затруднен; (11) гликозилировании; (12) животных; (13) генов; (14) фенотипических; (15) терапию; (16) растений; (17) устойчивые; (18) последовательностям; (19) зондов; (20) аномального; (21) плода; (22) Саузерну; (23) перенос; (24) полиморфизма; (25) уникальный; (26) индивидуума; (27) футпринтинга; (28) ПЦР.

Обзор вопросов в конце главы 24

∙Рестрикционная эндонуклеаза является ДНКазой с очень высокой специфичностью по отношению к узнаваемой последовательности оснований в месте разреза.

∙Основания этой последовательности в нативной ДНК метилированы и поэтому защищены от атаки собственной клеточной эндонуклеазой.

∙Два липких конца будут самопроизвольно спариваться, если последовательности комплементарны.

∙кДНК синтезируется на мРНК, у которой удалены последовательности интронов. Геномный клон представляет собой копию ДНК, содержащую интроны и промоторные последовательности.

∙Библиотеки ДНК представляют собой коллекцию клеточных линий (обычно E.coli), в которой каждый клон имеет различный фрагмент ДНК из другого источника. Исходно фрагменты «нарезаются» таким образом, что многочисленные комбинации начальных и концевых точек фрагментов дают представление о полной структуре гена. Система бактериофага λ удобна вследствие его способности к самосборке, упаковке ДНК и доставке фага в клетки E.coli.

∙Скрининг - это процесс выделения индивидуального клона из геномной библиотеки. После инфицирования клеток на первом этапе отбирают только те клетки, в которых присутствует фаг, содержащий чужеродную ДНК. На втором этапе отбирают отдельные колонии, содержащие искомый фрагмент ДНК, путем исследования фага, выращенного в этих клетках. Эта вторая селекция проводится с использованием радиоактивно меченых фрагментов ДНК - гибридизационных зондов, которые связывается с комплементарной последовательностью искомой ДНК и определяются, благодаря свойству радиоактивности оставлять след на рентгеновской пленке.

∙У дидезоксинуклеозидтрифосфатов в остатке сахара отсутствуют гидроксилы у Ñ-2′ è C-3′ атомов углерода. При использовании метода секвенирования по Сэнгеру эти соединения периодически останавливают полимеразную реакцию. Можно провести о корреляцию между размером фрагмента, синтезированного в случае такой терминации, и положением основания в последовательности ДНК. Например, ddCTP будет терминировать рост цепи там, где должно находиться основание С.

∙Полимеразная цепная реакция позволяет амплифицировать специфические фрагменты ДНК. Для использования этого метода необходимы праймеры к фрагментам ДНК для копирования искомой последовательности в обоих направлениях.

∙Экспрессирующие векторы используются для получения бактериальных штаммов, которые способны экспрессировать белки.

∙Распределение сайтов рестрикции является характеристикой индивидуума и его генетического строения.

Дополнительные вопросы к главе 24

1.Как дают названия ферментам рестрикции, такие, например, как EcoRI и BamHI?

2.Объясните, почему из библиотеки на основе бактериофага может быть получено неограниченное число фрагментов ДНК?

3.Какая из следующих последовательностей ДНК согласуется с участком матричной цепи для приведенного секвенирующего геля по Сэнгеру:

(à)5′ TCTGACCAG 3′

(á)5′ GACGGTCAG 3′

(â)5′ CTCATTGAG 3′

(ã)5′ GACCAGTCT 3′

(ä)5′ TGACTGGCT 3′?

A C G T

4.Какое преимущество перед любыми другими полимеразами дает при постановке ПЦР использование ДНК-полимеразы из термофильных бактерий?

5.Какие два пересчета необходимо сделать при чтении секвенирующего геля по Сэнгеру ?

6.Сколько цепей ДНК будет синтезировано, если четыре одноцепочечные молекулы ДНК подвергнуть пяти циклам ПЦР?

7.Что такое блот-анализ по Саузерну?

8.Что такое анализ генетической связи?

9.Какова логика использования RFLP-анализа в качестве метода футпринтинга?