34. Определение эффективности антимикробных

КОНСЕРВАНТОВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ (ОФС 42-0069-07)

Антимикробные консерванты - это вещества, обладающие антимикробным действием, которые добавляют в лекарственные средства для предотвращения роста и развития микроорганизмов, которые могут попасть в них во время технологического процесса или при неоднократном употреблении лекарственного средства. Консерванты входят в состав лекарственных средств. Для защиты пациента эффективная концентрация консерванта в готовом лекарственном средстве должна быть значительно ниже дозы, токсичной для человека.

Испытание эффективности антимикробных консервантов состоит из искусственного заражения лекарственного средства суспензиями определенных тест-микроорганизмов, инкубации контаминированных образцов при определенной температуре, отбора проб через указанные интервалы времени и подсчете жизнеспособных клеток микроорганизмов в 1 г или в 1 мл лекарственного средства на протяжении периода испытания. Предлагаемый метод определения эффективности консервантов применяется для готовых лекарственных средств в неповрежденной упаковке. Все лекарственные средства, в состав которых входят консерванты, разделены на четыре категории (табл. 34.1).

Таблица 34.1

Категории лекарственных средств, в состав которых

входят консерванты

Категория	Лекарственные средства
1	Инъекционные и другие парентеральные лекарственные средства, включая эмульсии. Лекарственные средства для введения в полость уха, носа (стерильные), офтальмологические средства, водорастворимые или приготовленные на водной основе
2	Лекарственные средства, применяемые местно, нестерильные лекарственные средства для введения в полость носа, эмульсии, в том числе и на слизистые
3	Лекарственные средства для приема внутрь, за исключением антацидов, водорастворимые или приготовленные на водной основе
4	Антацидные лекарственные средства, приготовленные на водной основе

Тест-микроорганизмы

Антимикробное действие консервантов определяют в отношении некоторых видов бактерий и грибов: Escherichia coli ATCC 25922, Pseu-domonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus ATCC 6538-P, Candida albicans NCTC 885-653, Aspergillus niger ATCC 9642.

Примечания

1. Помимо вышеперечисленных тест-штаммов можно использовать другие типовые штаммы одноименных видов микроорганизмов из национальных коллекций.

2. Набор тест-микроорганизмов может быть уменьшен или увеличен в зависимости от способа применения или состава испытуемого лекарственного средства.

Все культуры микроорганизмов, полученные из Национальных коллекций в ампулах, следует оживлять согласно прилагаемым инструкциям. Условия культивирования тест-микроорганизмов для приготовления инокулята представлены в табл. 34.2.

Таблица 34.2

Условия культивирования тест-микроорганизмов для

приготовления инокулята

Микроорганизм	Питательная среда <*>	Температура инкубации посевов	Время инкубации посевов
Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Staphylococcus aureus ATCC 6538-P	Соево-казеиновый агар или среда N 1, сухая Соево-казеиновый бульон или среда N 8, сухая	(32,5 +/- 2,5) град. C	от 18 до 24 ч
Candida albicans NCTC 885-653	Сабуро-глюкоза агар или среда N 2, сухая жидкая среда Сабуро	(22,5 +/- 2,5) град. C	от 44 до 52 ч
Aspergillus niger ATCC 9642	-//-	(22,5 +/- 2,5) град. C	от 6 до 10 сут.

--------------------------------

<*> Допускается использование альтернативных жидких и агаризованных питательных сред отечественного и зарубежного производства, зарегистрированных в РФ.

Приготовление инокулята

Выросшие культуры тест-штаммов бактерий и C.albicans смывают с

поверхности скошенного агара стерильным изотоническим раствором натрия

9

хлорида 0,9%. Концентрацию клеток бактерий доводят до 10 , a C.albicans до

7

10 КОЕ в 1 мл, используя отечественный стандартный образец мутности 10 ЕД

ОСО 42-28-59-85 или международный стандарт мутности (The International

Reference Preparation of Opacity of 10 International Units), или

инструментальный, в том числе турбодиметрический метод.

Для смыва конидий A.niger используют стерильный 0,9% раствор натрия хлорида, содержащий 0,05% твина-80. Количество конидий A.niger в 1 мл смыва определяют с помощью камеры Горяева или чашечным агаровым методом. Полученную взвесь разводят до концентрации 107 конидий в 1 мл.

Стандартизованные суспензии всех тест-микроорганизмов разводят до

7 8

концентрации 10 -10 КОЕ/мл.

Техника испытания

Отбирают препараты в конечной, неповрежденной упаковке. В 5 стерильных

флаконов помещают по 20 мл исследуемого препарата. В каждый флакон вносят

по 0,1 мл одного из приготовленных инокулятов тест-микроорганизмов: E.coli,

P.aeruginosa, S.aureus, C.albicans, A.niger и перемешивают. Лекарственные

средства категорий 1,2, 3 (табл. 34.1) контаминируют тест-микроорганизмами

5 6

в конечной концентрации 10 -10 КОЕ в 1 мл или 1 г. Для категории 4 (табл.

34.1) конечные концентрации тест-микроорганизма для искусственной

3 4

контаминации лекарственного средства должны быть в пределах от 10 до 10

КОЕ в 1 мл или 1 г.

Лекарственные средства, приготовленные на твердой мазевой основе, нагревают до температуры от (47,5 +/- 2,5) град. C. Используя стерильные стеклянные бусы или шпатель, смешивают каждый инокулят стандартизованной микробной суспензии с образцом лекарственного средства в течение не менее 1 мин. до достижения гомогенной эмульсии. Для улучшения смешивания можно добавить стерильное поверхностно-активное вещество, например твин-80, если оно не влияет на жизнеспособность микроорганизмов или на эффективность консерванта.

Фактическую исходную концентрацию бактерий и грибов в контаминированных образцах определяют сразу после контаминации чашечным агаровым методом посева на соответствующие питательные среды (табл. 34.2), используя подходящие разведения для получения на чашке от 30 до 300 колоний бактерий и от 10 до 100 колоний грибов. Можно также применять для этой цели метод мембранной фильтрации.

Контаминированные образцы лекарственного средства выдерживают при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в защищенном от света месте. Через 7, 14 и 28 сут. после инокуляции для препаратов 1 категории и через 14,28 сут. для препаратов 2-4 категории определяют количество жизнеспособных микроорганизмов в 1 мл образца.

В случае необходимости вводят инактиватор (нейтрализатор) на определенное антимикробное вещество в чашки с питательной средой или в соответствующее разведение лекарственного средства перед посевом на чашки.

Результаты испытания и их интерпретация

Чашечным агаровым методом определяют количество КОЕ/мл для каждого тест-микроорганизма через указанные выше сроки инкубации контаминированного лекарственного средства. Изменение количества микробных клеток по сравнению с исходной концентрацией в 1 мл выражают в десятичных логарифмах (log10). Для оценки эффективности антимикробного действия консервантов используют критерии, указанные в табл. 34.3.

Увеличение КОЕ/мл не фиксируется, если последующее измерение превышает предыдущее менее чем на 0,5 log10 единицы измерения.

Консерванты считают эффективными, если они соответствуют критериям, описанным в табл. 34.3.

Таблица 34.3

Критерии оценки эффективности антимикробных

консервантов лекарственных средств

В контаминированном образце
Категория	Бактерии	Грибы
1	По сравнению с исходной концентрацией уменьшение логарифма числа бактерий в 1 мл через 7 сут. должно быть не менее, чем на 1, через 14 сут. - не менее, чем на 3, а с 14 до 28 сут. не должно быть увеличения числа бактерий	По сравнению с исходной концентрацией через 7, 14, 28 сут. не должно быть увеличения числа грибов
2	По сравнению с исходной концентрацией уменьшение логарифма числа бактерий в 1 мл через 14 сут. должно быть не менее, чем на 2, а с 14 до 28 сут. не должно быть увеличения числа бактерий	По сравнению с исходной концентрацией через 14 и 28 сут. не должно быть увеличения числа грибов
3	По сравнению с исходной концентрацией уменьшение логарифма числа бактерий в 1 мл через 14 сут. должно быть не менее, чем на 1, а с 14 до 28 сут. не должно быть увеличения числа бактерий	По сравнению с исходной концентрацией через 14 и 28 сут. не должно быть увеличения числа грибов
Бактерии и грибы
4	По сравнению с исходной концентрацией через 14 и 28 сут. не должно быть увеличения числа бактерий и грибов

РЕАКТИВЫ