5. Биохимические тесты для идентификации микроорганизмов

5.1. Тест на наличие цитохромоксидазы

Реактив: 1% раствор N,N-диметил-пара-фенилендиамина дигидрохлорида.

Раствор хранят при температуре от 4 до 10 град. C во флаконах нейтрального светозащитного стекла. Раствор должен быть бесцветным.

Полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом. Платиновой петлей или стеклянной палочкой наносят 24-часовую чистую культуру исследуемых бактерий, выросших на соево-казеиновом агаре или среде N 1. Темно-красное окрашивание, появляющееся в течение 1 мин., свидетельствует о положительной оксидазной реакции. Положительным контролем служит культура P.aeruginosa, отрицательным - культура E.coli.

5.2. Тест на наличие индола

Реактив Ковача:

Спирта амилового или изоамилового - 75 мл

Пара-диметиламинобензальдегида - 5 г

Хлористоводородной кислоты конц. - 20 мл

Навеску альдегида растворяют в спирте при легком нагревании (на водяной бане при 50-55 град. C), остужают и медленно добавляют кислоту. Раствор хранят в защищенном от света месте при температуре от 4 до 10 град. C. Реактив должен быть желтого цвета. При неправильном хранении цвет реактива становится коричневым, и реактив непригоден для использования.

В пробирку с соево-казеиновым бульоном или со средой N 15, в которой выросла исследуемая культура, вносят 0,5 мл реактива Ковача и слегка встряхивают. Через несколько минут при наличии индола наблюдают появление красного кольца на поверхности среды в пробирке. Положительным контролем является культура E.coli, отрицательным - культура S.abony.

5.3. Тест на наличие коагулазы (реакция плазмокоагуляции)

Сухую цитратную кроличью плазму разводят согласно приложенной инструкции 0,9% стерильным раствором натрия хлорида изотоническим и разливают по 0,5 мл в стерильные пробирки. В пробирку помещают 1 петлю суточной культуры выделенных кокков, выращенных на соево-казеиновом агаре или на среде N 1. Положительным контролем служит культура S.aureus, отрицательным - культура S.epidermidis. Необходимо поставить также контроль неконтаминированной плазмы. Пробирки инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C. Реакцию плазмокоагуляции отмечают через каждый час в течение 4-6 ч, слегка наклоняя пробирку, но, не встряхивая ее.

При отсутствии положительной реакции плазмокоагуляции удлиняют время инкубации до 24 ч для получения окончательных результатов.

Тест на наличие коагулазы считается положительным при коагуляции плазмы.

6. Питательные среды. Определение ростовых и

селективных свойств

Для испытания лекарственных средств на стерильность и микробиологическую чистоту используют питательные среды отечественного или зарубежного производства.

Готовить питательные среды следует, строго придерживаясь приведенной рецептуры, а сухие питательные среды - согласно инструкции по применению предприятия-изготовителя. Необходимый pH питательных сред устанавливают при температуре (25 +/- 2) град. C. Среды стерилизуют в автоклаве в течение 15 мин. при температуре 121 град. C, если нет других указаний, при условии валидации процесса стерилизации.

Определение ростовых и селективных свойств проводят для каждой серии коммерческой среды (сухой и готовой к использованию), а также для каждой партии среды, изготовленной в лаборатории.

Питательные среды должны обеспечивать рост и развитие микроорганизмов-контаминантов лекарственных средств.

6.1. Рекомендуемые растворы и питательные среды

- Фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и пептоном pH 7,0

Калия фосфата однозамещенного 3,6 г

Натрия фосфата двузамещенного 7,2 г

Натрия хлорида 4,3 г

Пептона (мясного или казеинового) 1,0 г

Воды очищенной 1000 мл

- Полужидкий агар для хранения тест-микроорганизмов

Панкреатического гидролизата казеина 8,0 г

Натрия хлорида 5,0 г

Агара 5,0 г

Воды очищенной 1000 мл

pH после стерилизации 7,0 +/- 0,2

- Соево-казеиновый агар (Casein Soya Bean Digest Agar)

Панкреатического гидролизата казеина 15,0 г

Папаинового гидролизата бобов сои 5,0 г

Натрия хлорида 5,0 г

Агара 15,0 г

Воды очищенной 1000 мл

pH после стерилизации 7,3 +/- 0,2

Отечественная среда для выращивания аэробных бактерий - среда N 1 для

контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

- Агар Сабуро с глюкозой и антибиотиками (Sabouraud Glucose Agar with

antibiotics)

Пептона (мясного и казеинового) 10,0 г

Глюкозы моногидрата 40,0 г

Агара 15,0 г

Воды очищенной 1000 мл

pH после стерилизации 5,6 +/- 0,2

Отечественная среда для выращивания дрожжевых и плесневых грибов - среда

N 2 (агар Сабуро с глюкозой и антибиотиками) для контроля микробной

загрязненности, сухая, различных производителей.

Перед употреблением добавляют 0,1 г натриевой соли бензилпенициллина и

0,1 г тетрациклина на 1 л среды в виде стерильных растворов или добавляют

альтернативно 50 мг хлорамфеникола (левомицетина) на 1 л среды перед

стерилизацией.

- Бульон Мосселя для обогащения энтеробактерий (Enterobacteria Enrichment

Broth - Mossel)

Панкреатического гидролизата желатина 10,0 г

Глюкозы моногидрата 5,0 г

Бычьей желчи сухой 20,0 г

Калия фосфата однозамещенного 2,0 г

Натрия фосфата двузамещенного 8,0 г

Бриллиантового зеленого 0,015 г

Воды очищенной 1000 мл

pH 7,2 +/- 0,2

Среду нагревают при 100 град. C в течение 30 мин. с последующим быстрым

охлаждением.

Отечественная среда обогащения для энтеробактерий - среда N 3 для

контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

- Агар Мосселя (Crystal violet, Neutral Red, Bile Agai)

Дрожжевого экстракта 3,0 г

Панкреатического гидролизата казеина 7,0 г

Солей желчи 1,5 г

Лактозы моногидрата 10,0 г

Натрия хлорида 5,0 г

Глюкозы моногидрата 10,0 г

Агара 15,0 г

Нейтрального красного 0,03 г

Кристаллического фиолетового 0,002 г

Воды очищенной 1000 мл

pH 7,4+/-0,2

Нагревают до кипения. Нельзя нагревать в автоклаве.

Отечественная среда для выделения энтеробактерий - среда N 4 для контроля

микробной загрязненности, сухая, различных пооизводителей.

- Бульон Мак-Конки (MacConkey Broth)

Панкреатического гидролизата желатина 20,0 г

Лактозы моногидрата 10,0 г

Бычьей желчи сухой 5,0 г

Бромкрезолового пурпурного 10,0 г

Воды очищенной 1000 мл

pH после стерилизации 7,3 +/- 0,2

Отечественная среда обогащения для энтеробактерий - среда N 3 для

контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

- Агар Мак-Конки (MacConkey Agar)

Панкреатического гидролизата желатина 17,0 г

Пептона (мясного и казеинового) 3,0 г

Лактозы моногидрата 10,0 г

Натрия хлорида 5,0 г

Солей желчи 1,5 г

Агара 13,5 г

Нейтрального красного 0,03 г

Кристаллического фиолетового 0,001 г

Воды очищенной 1000 мл

pH после стерилизации 7,1 +/-0,2

Перед стерилизацией кипятят 1 мин., постоянно встряхивая.

Отечественная среда для выделения энтеробактерий - среда N 4 для контроля

микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

- Дезоксихолат цитрат агар (Deoxycholate Citrate Agar)

Мясного экстракта 10,0 г

Мясного пептона 10,0 г

Лактозы моногидрата 10,0 г

Натрия цитрата 20,0 г

Железа цитрата 1,0 г

Натрия дезоксихолата 5,0 г

Агара 13,5 г

Нейтрального красного 0,02 г

Воды очищенной 1000 мл

pH 7,3 +/- 0,2

Доводят до кипения на медленном огне и кипятят в течение 1 мин.,

охлаждают до 50 град. C и разливают в чашки Петри. Нельзя нагревать в

автоклаве.

- Ксилоза, лизин, дезоксихолат агар (Xylose, Lisine, Deoxycholate Agar)

Ксилозы 3,5 г

L-лизина 5,0 г

Лактозы моногидрата 7,5 г

Сахарозы 7,5 г

Натрия хлорида 5,0 г

Дрожжевого экстракта 3,0 г

Фенолового красного 0,08 г

Агара 13,5 г

Натрия дезоксихолата 2,5 г

Натрия тиосульфата 6,8 г

Железа аммоний цитрата 0,8 г

Воды очищенной 1000 мл

pH 7,4 +/- 0,2

Доводят до кипения, охлаждают до 50 град. C и разливают в чашки Петри.

Нельзя нагревать в автоклаве.

- Агар с бриллиантовым зеленым, феноловым красным, лактозой и сахарозой

(Brilliant Green Agar Medium)

Пептона (мясного и казеинового) 10,0 г

Дрожжевого экстракта 3,0 г

Натрия хлорида 5,0 г

Лактозы моногидрата 10,0 г

Сахарозы 10,0 г

Агара 20,0 г

Фенолового красного 0,08 г

Бриллиантового зеленого 0,0125 г

Воды очищенной 1000 мл

pH после стерилизации 6,9 +/- 0,2

Кипятят 1 мин. Используют сразу после автоклавирования.

- Висмут-сульфит агар (Bismuth Sulfite agar)

Мясного экстракта 5,0 г

Мясного пептона 10,0 г

Глюкозы моногидрата 5,0 г

Натрия фосфата двузамещенного 4,0 г

Железа сульфата 0,3 г

Бриллиантового зеленого 0,025 г

Висмута сульфита 8,0 г

Агара 15,0 г

Воды очищенной 1000 мл

pH 7,6 +/- 0,2

Среду не автоклавируют. Приготовленная среда мутная, зеленого цвета.

Отечественная среда для выделения сальмонелл - среда N 5 для контроля

микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

- Бульон с глюкозой (Dextrose Broth)

Мясного пептона 10,0 г

Мясного экстракта 3,0 г

Натрия хлорида 5,0 г

Глюкозы моногидрата 10,0 г

Бромкрезола пурпурного 0,02 г

Воды очищенной 1000 мл

pH после стерилизации 7,2 +/- 0,2

Отечественная среда для идентификации энтеробактерий - среда N 6 для

контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

- Нитратный бульон (Nitrate Broth)

Мясного пептона 8,6 г

Натрия хлорида 6,4 г

Калия нитрата 1,5 г

Воды очищенной 1000 мл

pH после стерилизации 7,2 +/- 0,2

Отечественная среда для идентификации энтеробактерий - среда N 7 для

контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

- Соево-казеиновый бульон (Casein Soya Bean Digest Broth)

Панкреатического гидролизата казеина 17,0 г

Папаинового гидролизата бобов сои 3,0 г

Натрия хлорида 5,0 г

Калия фосфата двузамещенного 2,5 г

Глюкозы моногидрата 2,5 г

Воды очищенной 1000 мл

pH после стерилизации 7,3 +/- 0,2

Отечественная среда для выращивания бактерий - среда N 8 для контроля

микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

- Цетримидный агар (Cetrimide Agar)

Панкреатического гидролизата желатина 20,0 г

Магния хлорида 1,4 г

Калия сульфата двузамещенного 10,0 г

Цетримида (цетилпиридиния бромида) 0,3 г

Агара 13,6 г

Глицерина 10,0 мл

Воды очищенной 1000 мл

pH после стерилизации 7,2 +/- 0,2

Отечественная среда для выделения синегнойной палочки - ЦПХ-агар для

выделения синегнойной палочки, сухая.

- ЦПХ-агар

Пептона сухого ферментативного 20,0 г

Калия сернокислого 7,6 г

Магния сернокислого семиводного 2,4 г

Соды кальцинированной 1,0 г

Фенозан-кислоты 0,2 г

ЦПХ (N-цетилпиридиния хлористого 1-водного) 0,3 г

Агара 8 г

Воды очищенной 1000 мл

рН 7,2 +/- 0,2

Среду не стерилизуют.

- Агар для выявления пиоцианина Pseudomonas (Pseudomonas Agar

Medium for Detection of Pyocyanin)

Панкреатического гидролизата желатина 20,0 г

Магния хлорида безводного 1,4 г

Калия сульфата безводного 10,0 г

Агара 15,0 г

Глицерина 10,0 мл

Воды очищенной 1000 мл

pH после стерилизации 7,2 +/- 0,2

Все компоненты, кроме глицерина, растворяют в воде. Нагревают при

перемешивании и кипятят 1 мин. Добавляют глицерин и стерилизуют.

Отечественная среда для идентификации синегнойной палочки - среда N 9 для

контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

- Агар Берда-Паркера (Baird-Parker Agar)

Панкреатического гидролизата казеина 10,0 г

Мясного экстракта 5,0 г

Дрожжевого экстракта 1,0 г

Лития хлорида 5,0 г

Агара 20,0 г

Глицина 12,0 г

Натрия пирувата 10,0 г

Воды очищенной 950 мл

pH после стерилизации 6,8 +/- 0,2

После стерилизации охлаждают до 45-50 град. C и добавляют 10 мл

стерильного 1% раствора калия теллурита и 50 мл коммерческой желточной

эмульсии.

- Агар Фогеля-Джонсона (Vogel-Johnson Agar Medium)

Панкреатического гидролизата казеина 10,0 г

Дрожжевого экстракта 5,0 г

Маннита 10,0 г

Калия фосфата двузамещенного 5,0 г

Лития хлорида 5,0 г

Глицина 10,0 г

Агара 16,0 г

Фенолового красного 0,025 г

Воды очищенной 1000 мл

pH после стерилизации 7,2 +/- 0,2

После стерилизации охлаждают до 45-50 град. C и добавляют 20 мл 1%

стерильного раствора калия теллурита.

Отечественная среда для выделения золотистого стафилококка - среда N 10

для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

- Лактозный бульон (Lactose Monohydrate Broth)

Мясного экстракта 3,0 г

Панкреатического гидролизата желатина 5,0 г

Лактозы моногидрата 5,0 г

Воды очищенной 1000 мл

pH после стерилизации 6,9 +/- 0,2

После стерилизации следует быстро охладить среду.

Отечественная среда для предварительного обогащения энтеробактерий -

среда N 11 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных

производителей.

- Тетратионатный желчный бульон с бриллиантовым зеленым (Tetra-thionate

Bile Brilliant Green Broth)

Пептона 8,6 г

Бычьей желчи сухой 8,0 г

Натрия хлорида 6,4 г

Кальция карбоната 20,0 г

Калия тетратионата 20,0 г

Бриллиантового зеленого 0,07 г

Воды очищенной 1000 мл

рН 7,0 +/- 0,2

Нагревают до кипения. Нельзя перегревать. Перед употреблением к 1000 мл

среды добавляют 20 мл раствора йода с калия йодидом (6 г йода

металлического, 5 г калия йодида, 20 мл воды очищенной).

Отечественная среда для выделения сальмонелл - среда N 12 для контроля

микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

- Трехсахарный агар с солями железа (Triple Sugar-Iron -Agar)

Мясного экстракта 3,0 г

Дрожжевого экстракта 3,0 г

Пептона (казеинового и мясного) 20,0 г

Натрия хлорида 5,0 г

Лактозы моногидрата 10,0 г

Сахарозы 10,0 г

Глюкозы моногидрата 1,0 г

Железо-аммоний цитрата 0,3 г

Натрия тиосульфата 0,3 г

Фенолового красного 0,025 г

Агара 12,0 г

Воды очищенной 1000 мл

pH после стерилизации 7,4 +/- 0,2

Среду разливают в пробирки, наполняя их на 1/3 объема. После стерилизации

среду скашивают таким образом, чтобы образовались столбик и косяк.

Отечественная среда для идентификации сальмонелл - среда N 13 для

контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

- Цитратный агар Симмонса

Натрия хлорида 5,0 г

Магния сульфата 0,2 г

Аммония дигидрофосфата 1,0 г

Калия гидрофосфата 1,0 г

Натрия цитрата 3,0 г

Бромтимолового синего 0,08 г

Агара 20 г

Воды очищенной 1000 мл

pH после стерилизации 7,2 +/- 0,2

Отечественная среда для идентификации E.coli - среда N 14 для контроля

микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

Примечание. Входящие в состав питательных сред индикаторы и красители добавляют в виде растворов определенной концентрации.

6.2. Ростовые и селективные свойства питательных сред

Основными биологическими критериями качества питательных сред являются их ростовые и селективные свойства, определяемые с помощью микроорганизмов и стандартных питательных сред. В качестве стандартных используют среды, готовые к употреблению, с сертификатом производителя, а также аттестованные в лаборатории среды высокого качества.

Ростовые свойства - это способность питательной среды обеспечивать эффективный и типичный рост соответствующих микроорганизмов.

Селективные свойства - это способность питательной среды частично или полностью подавлять рост сопутствующих микроорганизмов (ассоциантов) при обеспечении роста тест-штаммов.

Тест-микроорганизмы, штаммы-ассоцианты и условия инкубации для определения ростовых и селективных свойств питательных сред представлены в табл. 32.7.

Приготовление рабочей взвеси микроорганизмов

Культуры бактерий и C.albicans смывают с поверхности скошенного агара

стерильным 0,9% раствором натрия хлорида. Готовят стандартные взвеси

каждого тест-штамма, соответствующие 10 Единицам по стандартному образцу

мутности ОСО 42-28-85. Для культур Bacillus subtilis, Bacillus cereus и

7

Candida albicans - это концентрация 10 КОЕ/мл, для Escherichia coli,

9

Salmonella abony, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus - 10

КОЕ/мл. Стандартные взвеси методом последующих десятикратных разведений

2 3

доводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида до концентрации 10 и 10

КОЕ/мл. Для определения фактической концентрации рабочих взвесей бактерий и

3

C.albicans, высевают поверхностным методом из концентрации 10 КОЕ/мл по

0,1 мл на чашку с соответствующей агаризованной средой.

Для смыва конидий A.niger с агара Сабуро используют стерильный 0,9% раствор натрия хлорида, содержащий 0,05% твина-80. Количество конидий в 1 мл взвеси определяют с помощью камеры Горяева или посевом подходящего разведения на агар Сабуро.

Для посева готовят рабочую взвесь A.niger с концентрацией конидий

3

0,5 x 10 в 1 мл, которую высевают поверхностным методом по 0,1 мл на

чашки с агаром Сабуро.

Приготовленные рабочие взвеси монокультур используют для определения ростовых и селективных свойств питательных сред. Для определения селективных свойств дополнительно готовят посевную дозу, состоящую из равных количеств рабочих взвесей тест-микроорганизма и штамма-ассоцианта, при этом количество КОЕ штамма-ассоцианта должно быть на 2 порядка выше.

Определение ростовых свойств агаризованных сред

Испытуемую и стандартную агаризованные среды разливают в чашки Петри

диаметром 90 мм по 15 мл, подсушивая агар после застывания. По 0,1 мл

3

рабочей взвеси тест-микроорганизма с концентрацией 10 КОЕ/мл засевают

поверхностным методом на чашки с испытуемой и стандартной средами в тройной

повторности.

На агаризованных средах после инкубации описывают морфологические особенности колоний, подсчитывают колонии тест-микроорганизмов и определяют коэффициент прорастания по формуле:

N

К = ----,

N

o

где:

N - среднее арифметическое число колоний на чашке с испытуемой средой;

N - среднее арифметическое число колоний на чашке со стандартной

o средой.

Испытуемая агаризованная среда считается годной к употреблению, если коэффициент прорастания не менее 0,7 по сравнению со стандартной питательной средой.

Определение ростовых свойств жидких сред

Жидкие испытуемые и стандартные питательные среды разливают в

стерильные пробирки размером 15x150 мм по 10 мл. По 1,0 мл рабочей взвеси

2

тест-микроорганизма с концентрацией 10 КОЕ/мл засевают в 3 пробирки с

каждой средой. Рост микроорганизмов определяют визуально по помутнению

и/или изменению цвета среды после периода инкубации. Из пробирок, в которых

3

наблюдается рост, после предварительного разведения до 10 КОЕ/мл делают

пересев по 0,1 мл на соответствующую стандартную агаризованную среду. После

инкубации описывают морфологические особенности колоний, подсчитывают

колонии тест-микроорганизмов и определяют коэффициент прорастания по

указанной выше формуле.

Испытуемая жидкая среда считается годной к употреблению, если коэффициент прорастания не менее 0,7 по сравнению со стандартной жидкой питательной средой.

Определение селективных свойств

Для оценки селективных свойств питательных сред испытуемую и стандартную среды заражают взвесью тест-микроорганизмов (монокультура) и параллельно смесью тест-штамма и штамма-ассоцианта в определенной пропорции. В случае нескольких штаммов-ассоциантов каждый из них смешивают с тест-микроорганизмом отдельно.

Посев на агаризованные среды осуществляют поверхностным методом. В 3

чашки с каждой средой (испытуемой и стандартной) вносят по 0,1 мл рабочей

3

взвеси монокультуры, содержащей около 10 КОЕ/мл. Параллельно в 3 чашки с

каждой средой вносят по 0,1 мл посевной дозы, содержащей взвеси

тест-микроорганизма и штамма-ассоцианта. На всех засеянных чашках после

оптимального срока инкубации при соответствующей температуре отмечают рост

характерных колоний тест-микроорганизма при отсутствии или угнетении роста

штамма-ассоцианта.

Для посева на жидкие питательные среды (стандартную и испытуемую) аналогично используют монокультуру тест-микроорганизма и посевную дозу тест-микроорганизма со штаммом-ассоциантом. В 3 пробирки каждой среды вносят по 1 мл рабочей взвеси монокультуры тест-микроорганизма. Параллельно в 3 пробирки вносят по 1 мл посевной дозы тест-микроорганизма и штамма-ассоцианта.

Для качественной оценки селективных свойств среды через 24 ч инкубации делают пересев из каждой пробирки, в которой наблюдают рост, бактериологической петлей на чашки с соответствующей агаризованной средой. После инкубации на чашках должен наблюдаться рост характерных колоний тест-микроорганизма при отсутствии или угнетении роста штамма-ассоцианта.

Для характеристики питательных сред учитывают коэффициент прорастания и селективные свойства, а также морфологию выросших колоний.

Таблица 32.7

Тест-микроорганизмы и условия инкубации для

определения ростовых и селективных свойств

питательных сред

┌────────────────────────┬──────────────┬──────────────────────────────────┬───────────────────────┐

│ Питательные среды │ Назначение │ Тест-микроорганизмы │ Время и температура │

│ │ │ │ инкубации │

├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤

│ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │

├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤

│- Соево-казеиновый агар │Аэробные │Bacillus subtilis ATCC 6633 или │72 ч │

│- Среда N 1 для │бактерии │Bacillus cereus ATCC 10702; │(32,5 +/- 2,5) град. C │

│выращивания бактерий │ │Escherichia coli ATCC 25922; │ │

│ │ │Staphylococcus aureus ATCC 6538-P │ │

├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤

│- Сабуро агар с глюкозой│Дрожжи, │Candida albicahs NCTC 885-653 или │5 сут. │

│и антибиотиками │плесени │Candida albicans ATCC 10231; │(22,5 +/- 2,5) град. C │

│- Среда N 2 для │ │Aspergillus niger ATCC 9642 │ │

│выращивания грибов │ │ │ │

│ │ │Штаммы-ассоцианты: │ │

│ │ │Staphylococcus aureus ATCC 6538-P │ │

│ │ │Bacillus cereus ATCC 10702 │ │

├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤

│- Бульон Мосселя │Обогащение │Escherichia coli ATCC 25922; │24-48 ч │

│- Мак-Конки бульон │энтеробактерий│Salmonella abony IHE 103/39 │(32,5 +/- 2,5) град. C │

│- Среда N 3 для │ │ │ │

│обогащения │ │Штаммы-ассоцианты: │ │

│энтеробактерий │ │Staphylococcus aureus ATCC 6538-P │ │

│ │ │Bacillus cereus ATCC 10702 │ │

├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤

│- Мак-Конки агар │Энтеробактерии│Escherichia coli ATCC 25922; │24-48 ч │

│- Мосселя агар │ │Salmonella abony IHE 103/39 │(32,5 +/- 2,5) град. C │

│- Среда N 4 для │ │ │ │

│выделения энтеробактерий│ │Штаммы-ассоцианты: │ │

│ │ │Staphylococcus aureus ATCC 6538-P │ │

│ │ │Bacillus cereus ATCC 10702 │ │

├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤

│- Дезоксихолат-цитратный│Сальмонеллы │Salmonella abony IHE 103/39 │24-48 ч │

│агар │ │ │(32,5 +/- 2,5) град. C │

│- Ксилоза-лизин- │ │Штаммы-ассоцианты: │ │

│дезоксихолат агар │ │Escherichia coli ATCC 25922 │ │

│- Агар с бриллиантовым │ │Staphylococcus aureus ATCC 6538-P │ │

│зеленым │ │Bacillus cereus ATCC 10702 │ │

│- Висмут-сульфитный агар│ │ │ │

│- Среда N 5 для │ │ │ │

│идентификации сальмонелл│ │ │ │

├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤

│- Бульон с глюкозой │Энтеробактерии│Escherichia coli ATCC 25922; │24 ч │

│- Среда N 6 для │ │Salmonella abony IHE 103/39; │(32,5 +/- 2,5) град. C │

│идентификации │ │Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 │ │

│энтеробактерий │ │(P.aeruginosa ГИСК 453) │ │

├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤

│- Нитратный бульон │Энтеробактерии│Escherichia coli ATCC 25922; │24 ч │

│- Среда N 7 для │ │Salmonella abony IHE 103/39; │(32,5 +/- 2,5) град. C │

│идентификации │ │Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 │ │

│энтеробактерий │ │(P.aeruginosa ГИСК 453) │ │

├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤

│- Соево-казеиновый │Аэробные │Bacillus cereus ATCC 10702 или │24 ч │

│бульон │бактерии │Bacillus subtilis ATCC 6633; │(32,5 +/- 2,5) град. C │

│- Среда N 8 для │ │Escherichia coli ATCC 25922; │ │

│выращивания бактерий │ │Staphylococcus aureus ATCC 6538-P;│ │

│ │ │Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 │ │

│ │ │(P.aeruginosa ГИСК 453) │ │

├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤

│- Лактозный бульон │Энтеробактерии│Escherichia coli ATCC 25922; │24 ч │

│- Среда N 11 для │ │Salmonella abony IHE 103/39 │(32,5 +/- 2,5) град. C │

│предварительной │ │ │ │

│инкубации энтеробактерий│ │ │ │

├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤

│- Агар для выявления │Синегнойная │Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 │24-48 ч │

│пиоцианина P.aeruginosa │палочка │(P.aeruginosa ГИСК 453); │(32,5 +/- 2,5) град. C │

│- Среда N 9 для │ │Escherichia coli ATCC 25922 │ │

│идентификации │ │ │ │

│P.aeruginosa │ │ │ │

├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤

│- Цетримидный агар │Синегнойная │Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 │24-48 ч │

│- ЦПХ-агар │палочка │(P.aeruginosa ГИСК 453) │(32,5 +/- 2,5) град. C │

│для выделения │ │ │ │

│P.aeruginosa │ │Штаммы-ассоцианты: │ │

│ │ │Escherichia coli ATCC 25922; │ │

│ │ │Staphylococcus aureus ATCC 6538-P │ │

├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤

│- Фогель-Джонсона агар │Золотистый │Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р;│48 ч │

│- Среда N 10 для │стафилококк │Staphylococcus epidermidis АТСС │(32,5 +/- 2,5) град. C │

│выделения S.aureus │ │14990 │ │

│- Берда-Паркера агар │ │ │ │

│ │ │Штаммы-ассоцианты: │ │

│ │ │Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027 │ │

│ │ │(P.aeruginosa ГИСК 453); │ │

│ │ │Escherichia coli АТСС 25922 │ │

├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤

│- Селенитовый бульон │Сальмонеллы │Escherichia coli АТСС 25922; │18-24 ч │

│- Тетратионатный бульон │ │Salmonella abony IHE 103/39 │(32,5 +/- 2,5) град. C │

│- Среда N 12 для │ │ │ │

│выделения сальмонелл │ │ │ │

├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤

│- Трехсахарный агар с │Сальмонеллы │Escherichia coli ATCC 25922; │24 ч │

│солями железа │ │Salmonella abony IHE 103/39 │(32,5 +/- 2,5) град. C │

│- Среда N 13 для │ │ │ │

│идентификации сальмонелл│ │ │ │

├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤

│- Цитратный агар │Кишечная │Escherichia coli ATCC 25922; │24 ч │

│Симмонса │палочка │Salmonella abony IHE 103/39 │(32,5 +/- 2,5) град. C │

│- Среда N 14 для │ │ │ │

│идентификации E.coli │ │ │ │

└────────────────────────┴──────────────┴──────────────────────────────────┴───────────────────────┘

ATCC - Американская коллекция типовых культур (American Type Culture Collection), Соединенные Штаты Америки.

ГИСК - Всероссийский музей патогенных бактерий ГИСК им. Л.А.Тарасевича, Россия.

IHE - Институт гигиены и эпидемиологии, Прага, Чехия.

CCM - Чешская коллекция микроорганизмов.

Требование к ростовым свойствам питательных сред

Испытуемая агаризованная среда считается годной к употреблению, если коэффициент прорастания не менее 0,7 по сравнению со стандартной питательной средой. Испытуемая жидкая (полужидкая) среда считается годной к употреблению, если после инкубации рабочей взвеси и пересеве подходящего разведения на агаризованную среду коэффициент прорастания не менее 0,7 по сравнению со стандартной жидкой питательной средой.

Требование к селективным свойствам питательных сред

Испытуемая селективная питательная среда при посеве тест-микроорганизма и штамма-ассоцианта должна обеспечивать доминирующий рост тест-микроорганизма при частичном или полном угнетении роста штамма-ассоцианта.

Стерильность

Не менее 10% емкостей (флаконов, пробирок) от каждой партии приготовленной питательной среды контролируют на стерильность, выдерживая их при соответствующей температуре в течение 48-72 ч. При обнаружении микробного роста хотя бы в одной из емкостей, испытанию на стерильность подлежит вся приготовленная партия среды.

Хранение питательных сред

Сухие питательные среды необходимо хранить в сухом, защищенном от света месте при температуре 2-30 град. C герметично закрытыми. После вскрытия упаковки на флаконе необходимо написать дату и далее хранить при комнатной температуре до окончания срока годности.

Приготовленные из сухих смесей и разлитые во флаконы питательные среды хранятся 1 месяц при комнатной температуре или 3 месяца при (5 +/- 1) град. C.

Срок годности сред, разлитых в чашки, составляет 7 дней при температуре (5 +/- 1) град. C.

Исключение составляют чашки со средой N 4, срок годности которых не более 3 сут. без доступа света.