- •Министерство здравоохранения и социального развития
- •II. Предисловие
- •III. Организации, учреждения россии и специалисты,
- •XII издания
- •IV. Введение
- •1. Правила пользования фармакопейными статьями
- •2. Единицы международной системы (си),
- •3. Оборудование (офс 42-0033-07)
- •4. Температура плавления (офс 42-0034-07)
- •1. Капиллярный метод
- •2. Открытый капиллярный метод
- •3. Метод мгновенного плавления
- •4. Метод каплепадения
- •5. Температура затвердевания (офс 42-0035-07)
- •6. Температурные пределы перегонки и точка кипения
- •7. Плотность (офс 42-0037-07)
- •8. Вязкость (офс 42-0038-07)
- •9. Определение спирта этилового в жидких
- •10. Рефрактометрия (офс 42-0040-07)
- •11. Поляриметрия (офс 42-0041-07)
- •12. Спектроскопические методы
- •12.1. Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и
- •12.2. Спектрометрия в инфракрасной области
- •12.3. Атомно-эмиссионная и атомно-абсорбционная
- •12.4. Флуориметрия (офс 42-0045-07)
- •12.5. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса
- •13. Осмолярность (офс 42-0047-07)
- •1. Криоскопический метод
- •2. Метод мембранной осмометрии
- •3. Метод паровой осмометрии
- •14. Ионометрия (офс 42-0048-07)
- •1. Метод градуировочного графика
- •2. Метод стандартных добавок
- •3. Потенциометрическое определение pH
- •15. Растворимость (офс 42-0049-07)
- •16. Степень окраски жидкостей (офс 42-0050-07)
- •17. Прозрачность и степень мутности жидкостей
- •18. Определение азота в органических соединениях
- •1. Метод Къельдаля
- •2. Микрометод Къельдаля
- •3. Метод Къельдаля (обратное титрование)
- •19. Определение белка (офс 42-0053-07)
- •1. Спектрофотометрические методы
- •2. Колориметрические методы
- •1. Метод с биуретовым реактивом
- •2. Метод Лоури
- •3. Метод Бредфорда
- •4. Метод с бицинхониновой кислотой
- •3. Методы определения белка по содержанию азота
- •1. Метод Къельдаля
- •2. Метод с реактивом Несслера
- •4. Метод определения белка по аминокислотному составу
- •20. Нитритометрия (офс 42-0054-07)
- •21. Общая зола (офс 42-0055-07)
- •22. Сульфатная зола (офс 42-0056-07)
- •23. Остаточные органические растворители
- •1 Класса токсичности
- •2 Класса токсичности
- •24. Испытания на чистоту и допустимые пределы примесей
- •24.1. Железо (офс 42-0058-07)
- •24.2. Тяжелые металлы (офс 42-0059-07)
- •25. Аномальная токсичность (офс 42-0060-07)
- •26. Пирогенность (офс 42-0061-07)
- •27. Бактериальные эндотоксины (офс 42-0062-07)
- •28. Испытание на гистамин (офс 42-0063-07)
- •29. Испытание на депрессорные вещества (офс 42-0064-07)
- •30. Биологические методы оценки активности
- •1. Метод биологической оценки сердечных гликозидов
- •2. Метод биологической оценки сердечных гликозидов
- •31. Стерильность (офс 42-0066-07)
- •32. Микробиологическая чистота (офс 42-0067-07)
- •1. Определение антимикробного действия лекарственного средства
- •2. Особенности отбора и подготовки образцов для анализа
- •3. Методы количественного определения аэробных бактерий и грибов
- •4. Определение отдельных видов бактерий
- •5. Биохимические тесты для идентификации микроорганизмов
- •6. Питательные среды. Определение ростовых и
- •33. Определение антимикробной активности антибиотиков
- •34. Определение эффективности антимикробных
- •35. Реактивы. Индикаторы (офс 42-0070-07)
- •36. Титрованные растворы (офс 42-0071-07)
- •37. Буферные растворы (офс 42-0072-07)
- •38. Радиофармацевтические препараты (офс 42-0073-07)
- •39. Фармацевтические субстанции (офс 42-0074-07)
- •40. Сроки годности лекарственных средств
- •1. Общие положения
- •2. Порядок определения первоначального срока годности
- •3. Порядок изучения стабильности лекарственных средств
- •4. Условия хранения образцов при изучении стабильности
- •5. Порядок оформления и представления отчетных
28. Испытание на гистамин (офс 42-0063-07)
Настоящая статья распространяется на определение содержания гистамина in vitro в лекарственных средствах для парентерального применения.
Подготовка изолированного органа
В опыт берут морскую свинку-самца с массой тела 200-350 г. За 24 ч до эксперимента животное лишают пищи, но оставляют воду. После эвтаназии свинку обескровливают путем декапитации. Вскрывают брюшную полость от лонного сочленения до грудины и находят слепую кишку. Место ее перехода в ободочную кишку является ориентиром при поиске подвздошной кишки, которая отходит от слепой за 1-2 см до этого места.
Для того чтобы извлечь подвздошную кишку, тупым зажимом или пинцетом плотно захватывают ее основание и отрезают ножницами. Отсеченный конец кишки слегка приподнимают, а затем без натяжения и, не перехватывая ее, отсекают ткань брыжейки маленькими разрезами при помощи тупоконечных ножниц. Остатки брыжейки удалять не следует. Все манипуляции с подвздошной кишкой следует проводить осторожно, не растягивая ее. Для эксперимента пригоден дистальный участок подвздошной кишки, исключая 10-15 см, ближайшие к слепой кишке.
Подвздошную кишку нарезают на равные части (около 6 см каждая) и помещают в чашку Петри с гипокальциевым раствором Тироде (примечание 1). Им осторожно промывают полученные отрезки с помощью шприца или резиновой груши с пастеровской пипеткой с затупленным концом до полного удаления содержимого кишечника. Промытые отрезки подвздошной кишки помещают в чистый гипокальциевый раствор Тироде. Они могут быть использованы сразу или храниться в течение 24 ч при температуре от +2 до +4 град. C (примечание 2).
Непосредственно перед экспериментом промытый отрезок кишки разрезают до длины, требуемой условиями эксперимента (10 мм при использовании электронного датчика или 20 мм при использовании механического рычага и кимографа).
Приготовление разведений стандартного образца и
испытуемого лекарственного средства <*>
--------------------------------
<*> В дальнейшем, для удобства, испытуемое лекарственное средство будет называться "испытуемый препарат".
1. Разведения стандартного образца
В качестве стандартного образца используют гистамина дигидрохлорид в
-6
трех разведениях: разведение 1 (1,25 x 10 г/мл); разведение 2 (2,50 x
-6 -6
10 г/мл) разведение 3 (5,00 x 10 г/мл), вызывающие 50, 75 и 100%
сокращение кишки соответственно. В качестве растворителя используют 0,9%
раствор натрия хлорида.
2. Разведение испытуемого препарата (ИП)
Испытанию подвергают неразведенный ИП, когда максимально допустимая
нормативной документацией концентрация гистамина в неразведенном
-6
лекарственном средстве находится в диапазоне от 1,25 x 10 г/мл до 2,50 x
-6
10 г/мл. При необходимости ИП разводят 0,9% раствор натрия хлорида таким
образом, чтобы предполагаемая концентрация гистамина дигидрохлорида в
-6
разведении ИП составляла 2,50 x 10 г/мл.
Регистрирующая система
Для регистрации сокращений изолированного отрезка подвздошной кишки морской свинки в изотонических условиях в ответ на введение стандартного образца и ИП используют регистрирующую систему, состоящую из термостатируемой ванночки с гипокальциевым раствором Тироде (35 град. C), а также электронного датчика с самописцем или механического рычага с кимографом. Ванночку аэрируют карбогеном (95% O2 и 5% CO2) или воздухом. Нагрузка обычно составляет 500-800 мг. В случае использования механического рычага, для ее вычисления следует применять правило равновесия:
Сила x Плечо силы = Нагрузка x Плечо нагрузки.
Проведение опыта
Изолированный отрезок подвздошный кишки помещают в ванночку и прикрепляют к регистрирующей системе с помощью лигатуры по диагонали за противоположные концы: один - к крючку на дне ванночки, а другой - к датчику или рычагу. Прикладывают к отрезку нагрузку и оставляют его в покое на 30 мин. За это время необходимо не менее трех раз сменить в ванночке раствор Тироде.
1. Адаптация изолированного отрезка подвздошной кишки морской свинки к субмаксимальной дозе гистамина
В термостатируемую ванночку вводят стандартный образец в разведении 3 в объеме, равном 1/100 от ее емкости. Через 30 с (время экспозиции) ванночку промывают тройным объемом раствора Тироде. После первого отмывания проводят второе таким же объемом раствора. Не менее чем через 4 мин. после первого введения снова повторяют цикл "введение-экспозиция-два отмывания". Эти циклы повторяют до тех пор, пока не получат не менее двух одинаковых пиков. Их высоту принимают за 100% (примечание 3). Интервалы между введениями испытуемого вещества и между двумя отмываниями должны быть постоянными.
2. Испытание ИП на гистамин
Предварительное испытание
После достижения постоянной величины ответа отрезка кишки на введение стандартного образца в разведении 3, проводят испытание ИП на гистамин. Для этого с интервалом не менее 4 мин. однократно, в случайном порядке вводят стандартный образец в разведении 1, разведении 3 и ИП. Циклы "введение-экспозиция-два отмывания" такие же, как и при проведении адаптации органа к субмаксимальной дозе.
В случае если пик, полученный в ответ на введение ИП, по высоте не меньше, чем пик стандартного образца в разведении 1, проводят количественное определение содержания гистамина в ИП (2.1). Если пик, полученный в ответ на введение ИП, меньше пика стандартного образца в разведении 1 или вообще отсутствует, проводят контрольное испытание (2.2).
2.1. Количественное испытание ИП на гистамин
В случайном порядке поочередно вводят стандартный образец в разведении 1, разведении 3 и ИП до получения не менее чем четырех пиков в ответ на введение каждого раствора. Находят среднее значение ответа отрезка кишки на каждый раствор. С помощью регрессионного анализа вычисляют параметры линейной зависимости среднего ответа кишки на стандартный образец от логарифма его концентрации. Затем, подставляя полученные значения этих параметров в уравнение регрессии, вычисляют, какой концентрации гистамина в разведении ИП соответствует средняя высота его пика и, исходя из этого, рассчитывают содержание гистамина в неразведенном ИП (см. подраздел "Статистическая обработка результатов испытания на гистамин" общей фармакопейной статьи "Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний").
ИП считают прошедшим испытание, если найденное содержание гистамина не превышает максимально допустимое нормативной документацией (коэффициент пересчета с гистамина дигидрохлорида на гистамин-основание равен 0,6038).
2.2. Контрольное испытание
Схема его проведения такая же, как и при количественном определении
содержания гистамина в ИП, за исключением того, что вместо ИП используют
стандартный образец в разведении 2. Если средняя высота его пика
соответствует вводимой концентрации гистамина дигидрохлорида в данном
-6
разведении (2,50 x 10 г/мл), то результаты опыта следует признать
достоверными.
Результаты опыта следует признать недостоверными в каждом из следующих
случаев:
1) Средняя высота пика стандартного образца в разведении 2 не
соответствует вводимой концентрации гистамина дигидрохлорида в данном
-6
разведении (2,50 x 10 г/мл).
2) При количественном определении содержания гистамина в ИП отсутствует воспроизводимость ответов отрезка кишки на введение ИП.
3) В процессе эксперимента наблюдается статистически значимое снижение высоты пиков в ответ на серию введений одного и того же раствора (примечание 4).
В каждом из этих трех случаев следует провести испытание ИП на вещества депрессорного действия (см. "Испытание на депрессорные вещества").
Примечания
1. Состав и приготовление гипокальциевого раствора Тироде
Состав:
NaCl 80,00 г
NaHCO3 10,00 г
D-глюкоза 11,00 г
KCl 2,00 г
CaCl2 x 2H20 1,30 г
MgCl2 x 6H20 2,10 г
NaH2PO4 x H20 0,58 г
Воды дистиллированной до 10 л
Приготовление
В мерном цилиндре объемом 1 л растворяют в дистиллированной воде навески NaCl, NaHCO3 и D-глюкозы в любом порядке. Доводят объем раствора водой до 1 л и переливают содержимое цилиндра в 10-литровый стеклянный или полиэтиленовый сосуд с притертой пробкой или завинчивающейся крышкой.
Таким же образом, но по отдельности, каждую из оставшихся навесок растворяют в 1 л воды дистиллированной и по очереди переносят в тот же 10-литровый сосуд, строго придерживаясь следующего порядка:
1) KCl
2) CaCl2 x 2H20
3) MgCl2 x 6H20
4) NaH2PO4 x H2O
Затем доливают воду дистиллированную до отметки 10 л и вновь тщательно перемешивают.
Полученный раствор может храниться при температуре от +3 до +5 град. C не более 24 ч. Помутнение недопустимо.
Помутневший раствор следует вылить, тщательно промыть сосуд в проточной воде и прополоскать дистиллированной водой. Поверхностно активные моющие средства применять нельзя.
2. Сосуд, в котором находятся отрезки подвздошной кишки при хранении, плотно не закрывают, а затягивают двойным слоем марли, чтобы обеспечить доступ воздуха. Перед тем как отрезки использовать в опыте, их следует подготовить. Для этого сосуд в течение 10 мин. выдерживают при комнатной температуре и в течение 20 мин. в термостате (35 град. C). После нагревания из отрезка следует удалить слизь. Это достигается легкими поглаживающими движениями в продольном направлении.
3. Струя вводимого раствора должна быть направлена не прямо на изолированный отрезок кишки, а в сторону стенки ванночки, причем направление струи не должно меняться. Скорость введения должна быть максимально высокой и постоянной.
Регистрацию сокращений проводят непрерывно (скорость ленты - 2 мм/мин.). В случае использования механического рычага и кимографа, писчик во время отмывания можно отводить и прекращать запись.
4. Каждую серию, состоящую не менее чем из четырех пиков, полученных в результате введения одного и того же раствора, следует проверять на дрейф с помощью теста Нойманна:
n - 1 2
n SUM (x - x )
i = 1 1 i + 1
D = -------------------------,
n 2 2
n SUM x - (SUM x )
i = 1 i
где: x - высота пика на введение одного и того же раствора;
n - число пиков, полученных в результате введения одного и того же раствора.
Значение D должно быть (p < 0,05):
при n = 4 - меньше 0,78;
при n = 5 - меньше 0,82;
при n = 6 - меньше 0,89.