- •Министерство здравоохранения и социального развития
- •II. Предисловие
- •III. Организации, учреждения россии и специалисты,
- •XII издания
- •IV. Введение
- •1. Правила пользования фармакопейными статьями
- •2. Единицы международной системы (си),
- •3. Оборудование (офс 42-0033-07)
- •4. Температура плавления (офс 42-0034-07)
- •1. Капиллярный метод
- •2. Открытый капиллярный метод
- •3. Метод мгновенного плавления
- •4. Метод каплепадения
- •5. Температура затвердевания (офс 42-0035-07)
- •6. Температурные пределы перегонки и точка кипения
- •7. Плотность (офс 42-0037-07)
- •8. Вязкость (офс 42-0038-07)
- •9. Определение спирта этилового в жидких
- •10. Рефрактометрия (офс 42-0040-07)
- •11. Поляриметрия (офс 42-0041-07)
- •12. Спектроскопические методы
- •12.1. Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и
- •12.2. Спектрометрия в инфракрасной области
- •12.3. Атомно-эмиссионная и атомно-абсорбционная
- •12.4. Флуориметрия (офс 42-0045-07)
- •12.5. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса
- •13. Осмолярность (офс 42-0047-07)
- •1. Криоскопический метод
- •2. Метод мембранной осмометрии
- •3. Метод паровой осмометрии
- •14. Ионометрия (офс 42-0048-07)
- •1. Метод градуировочного графика
- •2. Метод стандартных добавок
- •3. Потенциометрическое определение pH
- •15. Растворимость (офс 42-0049-07)
- •16. Степень окраски жидкостей (офс 42-0050-07)
- •17. Прозрачность и степень мутности жидкостей
- •18. Определение азота в органических соединениях
- •1. Метод Къельдаля
- •2. Микрометод Къельдаля
- •3. Метод Къельдаля (обратное титрование)
- •19. Определение белка (офс 42-0053-07)
- •1. Спектрофотометрические методы
- •2. Колориметрические методы
- •1. Метод с биуретовым реактивом
- •2. Метод Лоури
- •3. Метод Бредфорда
- •4. Метод с бицинхониновой кислотой
- •3. Методы определения белка по содержанию азота
- •1. Метод Къельдаля
- •2. Метод с реактивом Несслера
- •4. Метод определения белка по аминокислотному составу
- •20. Нитритометрия (офс 42-0054-07)
- •21. Общая зола (офс 42-0055-07)
- •22. Сульфатная зола (офс 42-0056-07)
- •23. Остаточные органические растворители
- •1 Класса токсичности
- •2 Класса токсичности
- •24. Испытания на чистоту и допустимые пределы примесей
- •24.1. Железо (офс 42-0058-07)
- •24.2. Тяжелые металлы (офс 42-0059-07)
- •25. Аномальная токсичность (офс 42-0060-07)
- •26. Пирогенность (офс 42-0061-07)
- •27. Бактериальные эндотоксины (офс 42-0062-07)
- •28. Испытание на гистамин (офс 42-0063-07)
- •29. Испытание на депрессорные вещества (офс 42-0064-07)
- •30. Биологические методы оценки активности
- •1. Метод биологической оценки сердечных гликозидов
- •2. Метод биологической оценки сердечных гликозидов
- •31. Стерильность (офс 42-0066-07)
- •32. Микробиологическая чистота (офс 42-0067-07)
- •1. Определение антимикробного действия лекарственного средства
- •2. Особенности отбора и подготовки образцов для анализа
- •3. Методы количественного определения аэробных бактерий и грибов
- •4. Определение отдельных видов бактерий
- •5. Биохимические тесты для идентификации микроорганизмов
- •6. Питательные среды. Определение ростовых и
- •33. Определение антимикробной активности антибиотиков
- •34. Определение эффективности антимикробных
- •35. Реактивы. Индикаторы (офс 42-0070-07)
- •36. Титрованные растворы (офс 42-0071-07)
- •37. Буферные растворы (офс 42-0072-07)
- •38. Радиофармацевтические препараты (офс 42-0073-07)
- •39. Фармацевтические субстанции (офс 42-0074-07)
- •40. Сроки годности лекарственных средств
- •1. Общие положения
- •2. Порядок определения первоначального срока годности
- •3. Порядок изучения стабильности лекарственных средств
- •4. Условия хранения образцов при изучении стабильности
- •5. Порядок оформления и представления отчетных
3. Метод Бредфорда
Метод основан на измерении светопоглощения продукта взаимодействия красителя кислотного синего 90 с белком при длине волны 595 нм. Связывание красителя происходит в анионной форме преимущественно с остатками аргинина и в меньшей степени с остатками лизина, гистидина, триптофана и фенилаланина белка.
Методика. 0,1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,04-0,05 мг белка, помещают в пробирку, прибавляют 5 мл реактива Бредфорда, тщательно перемешивают и через 10 мин. измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 595 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм против раствора сравнения, содержащего растворитель и реактив Бредфорда. Окраска стабильна в течение 1 часа. Для соблюдения линейной зависимости оптической плотности определяемого белка от его концентрации конечная концентрация белка в растворе красителя должна быть 0,008-0,010 мг/мл. В частных фармакопейных статьях допускается изменение объемов испытуемого раствора и реактива Бредфорда с соблюдением данного условия.
Содержание белка в растворе рассчитывают по калибровочному графику, построенному в пределах от 0,01 до 0,10 мг стандартного образца белка в 0,1 мл раствора.
Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.
Примечание. Приготовление реактива Бредфорда. В мерную колбу вместимостью 500 мл помещают 0,05 г кислотного синего 90, растворяют в 25 мл спирта 96%, прибавляют 50 мл фосфорной кислоты концентрированной, доводят объем раствора водой до метки и тщательно перемешивают.
Реактив хранят при комнатной температуре во флаконе темного стекла. Срок годности - 2 недели.
Перед использованием реактив фильтруют.
Допускается использование коммерческого реактива Бредфорда.
4. Метод с бицинхониновой кислотой
Метод основан на восстановлении двухвалентного иона меди в одновалентный при взаимодействии с остатками цистеина, цистина, триптофана, тирозина, пептидной связью белка и образовании окрашенного комплекса CU+ с бицинхониновой кислотой (2,2'-бихинолин-4,4'-дикарбоновая кислота-БХК). Определению мешают восстанавливающие вещества: сахара, аскорбиновая кислота, тиоловые соединения, этилендиаминтетраацетат. Влияние мешающих веществ может быть уменьшено разбавлением испытуемого раствора или устранено отделением белка путем его осаждения, описанного в методе Лоури. Интенсивность окраски образующегося комплекса зависит от природы белка, поэтому белок стандартного образца должен быть тот же, что и в испытуемом образце.
Методика. К 0,1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,025-0,05 мг белка; 0,1 мл раствора стандартного образца белка и к 0,1 мл растворителя, используемого для приготовления испытуемого раствора, прибавляют 2 мл реагента меди с БХК. Выдерживают растворы при 37 град. C в течение 30 мин., охлаждают при комнатной температуре и через 60 мин. (от конца выдержки при 37 град. C) измеряют оптическую плотность испытуемого и стандартных растворов на спектрофотометре при длине волны 562 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения.
Содержание белка в испытуемом растворе рассчитывают по калибровочному графику.
Примечания
1. Приготовление БХК-реагента. В мерной колбе вместимостью 1 л в воде растворяют 10 г бицинхониновой кислоты (БХК) или ее динатриевой соли, 20 г натрия карбоната моногидрата, 1,6 г натрия тартрата, 4 г натрия гидроксида, 9,5 г натрия гидрокарбоната, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают; pH полученного раствора должен быть 11,25. При необходимости pH доводят раствором натрия гидроксида 10% или натрия гидрокарбоната 5%.
2. Приготовление реагента меди с БХК. Смешивают 1 мл 4% раствора меди сульфата и 50 мл БХК-реагента.