12.4. Флуориметрия (офс 42-0045-07)

Флуориметрия (или флуоресцентная спектрофотометрия) основана на измерении флуоресценции - интенсивности флуоресцентного света, излучаемого испытуемым образцом в возбужденном состоянии, которое было достигнуто поглощением лучевой энергии в результате воздействия ультрафиолетового, видимого или других видов электромагнитного излучения. Флуоресценция органических соединений охватывает спектральную область от 250 до 800 нм, т.е. области: УФ (частично), видимую и начало ближнего ИК.

Энергия молекул, поглотивших лучевую энергию и находящихся в возбужденном состоянии, может высвобождаться в виде тепла или излучения при той же или большей длине волны по сравнению с поглощаемым излучением. Поэтому свет, излучаемый флуоресцентным раствором, имеет максимум интенсивности, смещенный в более длинноволновую область по сравнению с возбуждающим излучением, обычно на 20-30 нм.

Поскольку поглощение и испускание излучения осуществляется благодаря

переходу электронов между различными уровнями энергии или молекулярными

орбитами, между поглощением и испусканием света имеется задержка во

времени. Этот интервал (продолжительность возбужденного состояния)

-9 -8

составляет от 10 до 10 с для большей части флуоресцирующих растворов.

Короткое время жизни флуоресценции отличает этот тип люминесценции от

фосфоресценции, которая представляет собой долгоживущее свечение, имеющее

-3

время жизни от 10 с до нескольких мин.

Флуориметрия является более чувствительным методом анализа, чем абсорбционная спектрофотометрия, и позволяет определять флуоресцирующие вещества в растворах с концентрацией, которая составляет примерно от 1/10 до 1/100 от концентрации, используемой в абсорбционной спектрофотометрии.

Интенсивность флуоресценции обозначается символом I и представляет собой эмпирическое выражение флуоресцентной активности в условных единицах, пропорциональных отклику детектора.

Флуоресцентный спектр испускания представляет собой графическое изображение спектрального распределения излучения, испускаемого активированным веществом, в координатах: интенсивность испускаемого излучения - ордината, длина волны - абсцисса.

Флуоресцентный спектр возбуждения представляет собой графическое изображение спектра активации в координатах: интенсивность испускаемого излучения - ордината, длина волны активирующего излучения - абсцисса.

Приборы. Для проведения флуориметрического анализа используют приборы двух типов: фильтрационный флуориметр и спектрофлуориметр.

Фильтрационный флуориметр состоит из источника излучения, первичного фильтра, камеры для образца, вторичного фильтра и системы детектирования флуоресценции. У большей части таких приборов детектор помещен под углом 90 град. к возбуждающему лучу. Геометрия прямого угла позволяет возбуждающему излучению пройти через испытуемый образец, не "загрязняя" произведенный сигнал, передаваемый на детектор флуоресценции. Однако детектор все-таки получает возбуждающее излучение, искаженное в результате рассеивающих свойств самих растворов, а также из-за присутствия в растворе пыли или других твердых частиц. Для устранения этого остаточного рассеяния используются фильтры. Первичный фильтр отбирает коротковолновое излучение, способное к возбуждению испытуемых образцов, вторичный фильтр пропускает флуоресценцию в длинноволновой области, но блокирует рассеянное возбуждение.

Большинство флуориметров в качестве детекторов используют фотоумножители разных типов. Каждый тип детектора имеет специальные характеристики (спектральная область максимальной чувствительности, усиление, электрические шумы). Фототок усиливается и регистрируется измерительным прибором или самописцем.

Спектрофлуориметры отличаются от фильтрационных флуориметров тем, что вместо фильтров используются монохроматоры типа призмы или решетки. Для аналитических целей эти приборы более предпочтительны. В спектрофлуориметрах монохроматоры снабжены щелями. Узкая щель дает высокое разрешение и спектральную чистоту, широкая щель обеспечивает высокую чувствительность. Выбор размера щели определяется разделением между длинами волн возбуждения и испускания и необходимой чувствительностью.

Кюветы, используемые для измерения флуоресценции, представляют собой кюветы цилиндрической формы или прямоугольные кюветы, отполированные со всех четырех вертикальных сторон. Обычно объем испытуемых образцов составляет 2-3 мл, но к некоторым приборам прилагаются кюветы вместимостью от 100 до 300 мкл или капиллярные держатели для еще меньшего объема.

Измерение флуоресценции. Практически флуоресценцию определяют в

-5

растворах с концентрацией от 10 М и менее, когда между интенсивностью

флуоресценции и концентрацией вещества наблюдается прямолинейная

зависимость. При более высоких концентрациях значительная часть

поступающего света абсорбируется образцом вблизи поверхности кюветы, и

интенсивность света, достигающего центра, уменьшается. При этом образец

действует как "внутренний фильтр", в результате чего линейность нарушается.

Все замеры интенсивности флуоресценции должны быть скорректированы с растворителем.

Интенсивность флуоресценции в значительной степени зависит от длины волны возбуждающего света, величины pH испытуемого раствора, температуры, характера растворителей и присутствия в растворе посторонних частиц.

Твердые частицы, влияющие на флуоресценцию (могут поглощать некоторую долю возбуждающей энергии, дезактивировать возбужденные молекулы или завышать измеряемую величину из-за многократных отражений в кювете с образцом), удаляют центрифугированием или фильтрованием. В последнем случае следует учесть, что некоторые сорта фильтровальной бумаги содержат флуоресцирующие примеси.

Для некоторых веществ эффективность флуоресценции может снизиться на 1-2% при повышении температуры на градус. В таких случаях следует использовать термостатированные кюветы с контролируемой температурой. В рутинном анализе может оказаться достаточным сделать измерение быстро, чтобы не произошло нагревания образца от источника облучения.

Флуоресцентные вещества чувствительны к свету. При выдержке во флуориметре они могут подвергаться фотораспаду с образованием других флуоресцирующих продуктов. Такие эффекты обнаруживаются по отклику детектора в зависимости от времени и могут быть снижены применением фильтров или экрана после источника света.

Изменение растворителя может заметно повлиять на интенсивность и спектральное распределение флуоресценции. Многие соединения, флуоресцирующие в органических растворителях, фактически не флуоресцируют в воде, поэтому для того, чтобы решить, является вещество флуоресцентным или нет, надо исследовать его в различных растворителях.

Для многих органических растворителей интенсивность флуоресценции возрастает при удалении растворенного кислорода, являющегося сильным гасителем флуоресценции. Кислород может быть удален пропусканием инертного газа (азот или гелий) через испытуемый образец.

Применение флуориметрии в фармацевтическом анализе

Идентификация. Характер спектра флуоресценции, а также цвет излучаемого света специфичны для флуоресцирующих веществ. Поэтому флуоресценция может быть применена для идентификации веществ.

Количественный анализ. При количественных определениях интенсивность флуоресценции испытуемого образца сравнивают с интенсивностью флуоресценции стандартного образца флуоресцирующего вещества известной концентрации, измеренной в идентичных условиях на одном и том же приборе.

Методика. Растворяют испытуемый образец в растворителе или в смеси растворителей, указанных в частной фармакопейной статье. Переносят раствор в кювету флуориметра и освещают лучом возбуждающего света с длиной волны, указанной в частной фармакопейной статье.

Вначале в прибор помещают растворитель или смесь растворителей, используемых для растворения вещества, и устанавливают прибор на "ноль". Затем вводят стандартный раствор и устанавливают чувствительность прибора таким образом, чтобы замер был больше 50. Если повторное доведение чувствительности производится при изменении ширины щели, должна быть произведена переустановка "нуля" и интенсивность флуоресценции стандартного образца должна быть измерена вновь. Последним вводят раствор испытуемого образца неизвестной концентрации и замеряют показания прибора.

Рассчитывают концентрацию вещества в испытуемом растворе (C ) по

формуле: x

I x C

x ст.

C = -----------,

x I

ст.

где:

C - концентрация вещества в стандартном растворе;

ст.

I - интенсивность света, испускаемого испытуемым раствором;

x

I - интенсивность света, испускаемого стандартным раствором.

ст.

Если интенсивность флуоресценции не прямо пропорциональна концентрации, измерение может быть произведено с использованием калибровочной кривой.

В некоторых случаях измерение может быть сделано относительно фиксированного стандарта (например, флуоресцентного стекла или раствора другого флуоресцентного вещества). В качестве стандартов могут быть использованы: раствор известной концентрации хинина в 0,05 М растворе серной кислоты или раствор флуоресцеина в 0,1 М растворе натрия гидроксида. В таких случаях концентрацию испытуемого образца следует определять с использованием предварительно полученной в тех же условиях калибровочной кривой.