Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Рководство по туберкулезу.doc
Скачиваний:
952
Добавлен:
20.05.2015
Размер:
1.92 Mб
Скачать

3.8.1 Определение теста на лекарственную чувствительность к птп

Существуют 2 метода определения теста на лекарственную чувствительность (ТЛЧ) к ПТП:

  1. метод абсолютной концентрации

  2. метод пропорций

3.8.1.1 Метод абсолютных концентраций на плотных средах для определения чувствительности к птп первого ряда

В соответствии с критериями устойчивости в опытах по её изучению рекомендуется пользоваться следующими концентрациями туберкулостатических препаратов:

Используемые концентрации антибактериальных препаратов 1 линии:

  1. Изониазид 1; 5 мкг/мл

  2. Рифампицин 40 мкг/мл

  3. Этамбутол 2; 5 мкг/мл

  4. Стрептомицин 5; 10 мкг/мл

32

Таблица 5 - Критерии устойчивости микобактерий туберкулёза к ПТП

ПТП 1ряда

Микобактерий, устойчивые при росте на среде, содержащей препарат в концентрации (в мкг/мл)

1. Изониазид 2. Рифампицин З.Этамбутол 4. Стрептомицин

1

2 3 4

Таблица 6 - Активность чистых лекарств

( мкг активной субстанции на мг веса продукта)

Лекарства

мкг активной субстанции на 1 мг

Изониазид

1.000 (100%)

Дигидрострептомицин сульфат

750-850 (75-85%)

Этамбутол гидрохлорид

890 (89%)

Рифампицин

1.000 (100%)

Активность лекарства варьирует от одной партии/серии лекарств к другой. Эти важ­ные сведения обычно приводятся на этикетках контейнеров лекарств, упаковках или их можно получить от компании-изготовителя.

3.8.1.2 Метод пропорций на плотных средах для определения чувствительности к основным птп

Метод пропорций широко используется в мире. Для выполнения этого метода ис­пользуется среда Левенштейна-Йенсена (Л-Й), и устойчивость тестируемых штам­мов определяется отношением числа колоний выросших на среде с лекарствами к числу колоний, выросших на среде без лекарств.

Этот показатель позволяет определить наличие устойчивых мутантов в общей попу­ляции жизнеспособных колониеобразующих единиц. Для получения подсчитывае­мого числа колоний, выросших на среде Л-Й, рекомендуется посев 2 разведений. Преимущество данного метода в том, что в исследовании используется стандарт­ный инокулят и можно подсчитать число колоний, выросших на Л-Й.

Приготовление питательной среды с лекарствами

Большую важность для получения точных результатов ТЛЧ представляет приготов­ление среды, содержащей лекарственный препарат. Ниже приведены критические концентрации лекарственных препаратов в среде Л-Й: Изониазид 0,2 мкг/мл Стрептомицин 4 мкг/мл Рифампицин 40 мкг/мл Этамбутол 2 мкг/мл

При приготовлении среды с препаратами необходимо учитывать активность препа­рата, которая может варьировать от одной партии/серии лекарств к другой и в зави­симости от его производителя. Эти сведения приводятся на этикетках контейнеров, упаковках или предоставляются компанией-изготовителем.

33

Изониазид:

Содержание активного вещества 1000 мкг/мл

1) Приготовление растворов лекарственных препаратов:

  1. 20 мг изониазида растворить в 10 мл дистиллированной воды - полученный раствор имеет концентрацию 2000 мкг/мл

  2. 1 мл приготовленного раствора (2000мкг/мл) растворить в 9 мл дистиллиро­ ванной воды; полученный раствор имеет концентрацию 200 мкг/мл

  3. 1 мл раствора (200 мкг/мл) растворить в 9 мл дистиллированной воды - полу­ ченный рабочий раствор имеет концентрацию 20 мкг/мл

  1. 2 мл рабочего раствора (20 мкг/мл) добавить к 200 мл среды Л-Й

  2. Питательную среду с лекарственным препаратом разлить в пробирки по 6 мл

  3. Свертывание среды проводится при 900 С в течение 50 мин.

Стрептомицин:

Содержание активного вещества 780 - 800 мкг/мг

Процедура приготовления среды с 4 мкг/мл (чистое вещество 780мкг/мг)

  1. Приготовление раствора лекарственного препарата: 5,1 мг S растворить в 10 мл дистиллированной воды - полученный раствор имеет концентрацию 400 мкг/мл

  2. 2 мл полученного раствора добавить к 200 мл среды Л-Й

  3. Питательную среду с лекарственным препаратом разлить в пробирки по 6 мл

  4. Свертывание среды проводится при 900 С в течение 50 мин

Рифампицин:

Содержание активного вещества 1,000 мкг/мл

  1. Приготовление раствора лекарственного препарата: 40 мг R растворить в 10 мл пропиленгликоля, встряхивая на водяной бане при 700С - полученный раствор име­ ет концентрацию 400 мкг/мл

  2. 2 мл полученного раствора добавить к 200 мл среды Л-Й

  3. Питательную среду с лекарственным препаратом разлить в пробирки по 6 мл

  4. Свертывание среды проводится при 900 С в течение 50 мин

Этамбутол:

Содержание активного вещества 1,000 мкг/мл Приготовление раствора лекарственного препарата:

  1. 20 мг Е растворить в 10 мл дистиллированной воды - полученный раствор имеет концентрацию 2000 мкг/мл

  2. Добавить 1 мл полученного раствора (2000 мкг/мл) к 9 мл дистиллированной воды - полученный рабочий раствор имеет концентрацию 200 мкг/мл

  3. 2 мл рабочего раствор добавить к 200 мл среды Л-Й

  4. Питательную среду с лекарственным препаратом разлить в пробирки по 6 мл

  5. Свертывание среды проводится при 900 С в течение 50 мин

Приготовление бактериальной суспензии

Выросшую культуру микобактерий снимают с питательной среды Л-Й с помощью металлической петли и помещают в пробирку с 5-6 стеклянными бусами. При ис­пользовании металлической петли в пробирку внести предварительно 2 капли сте­рильной дистиллированной воды. Пробирку с бактериальной массой гомогенизиру­ют в течение 1-2 минут на встряхивателе "Vortex", затем добавляют 7 мл дистилли­рованной воды и снова осторожно встряхивают до образования однородного ра­створа

Полученную суспензию оставляют на 1-3 минуты до осаждения крупных частиц. Затем гомогенную взвесь (верхнюю часть суспензии) собирают и переносят в сте-

34

рильную пробирку. Мутность гомогенной взвеси сравнивают со стандартом Мак-Фар ланда №1, постепенно добавляя дистиллированную воду до тех пор, пока густо­та взвеси не сравняется с густотой стандарта. Полученная суспензия называется

рабочей суспензией".

В дальнейшем из рабочей суспензии готовятся последовательные десятикратные разведения: 10-1; 10-2; 10-3; и 10-4

тля каждой суспензии используются разные 1мл градуированные пипетки).

Посев бактериальной суспензии:

  1. в 2 пробирки со средой Л-Й без лекарств (контрольная пробирка) делают посев 0,1 мл суспензии разведенной до 10-2 , 10-4 и распределяют по всей поверхности среды.

  2. в 2 пробирки со средой Л-Й, содержащей каждое лекарство делают посев 0,1 мл суспензии разведенной до 10-2 и распределяют по всей поверхности сре­ ды.

Пробирки в термостате хранят в наклонном положении с неплотно прикрытыми крышками при температуре 370 С, до появления видимого роста на среде без ле­карств, после чего в течение 4-6 недель с закупоренными пробками.

Интерпретация результатов

Критерием устойчивости является 1 % роста бактериальной популяции для всех этих препаратов. Через 4 недели инкубации, рост на среде, не содержащей лекарства, ;шокулированной из суспензии 10-4 сравнивают с ростом на среде с препаратом, ;гнокулированной из суспензии 10-2. Если число колоний больше на среде, содержа-шей лекарство, тестируемый штамм считается устойчивым.

Так как отношение 10-2 и 10-4 является как 1:100, то следующая формула может использоваться для подсчета % устойчивости:

Число колоний на среде с лекарствами в разведении 1Q-2 = % устойчивости Число колоний на среде без лекарств в разведении 10-4

Если рост бактерий на питательной среде, содержащей лекарство, превышает 1%, штамм считается устойчивым.