6. Антибиотики, полученные методом биотехнологического производства, имеют определенные физико-химические свойства, влияющие на выбор методов их выделения и очистки.

О каких физико-химических свойствах идет речь?

Какие методы выделения и очистки антибиотиков можно предложить?

Ответ

Современное производство антибиотиков – сложная многоступенчатая биотехнологическая система, состоящая из ряда последовательных стадий.

1 стадия – биосинтез (образование) антибиотика. Главная задача на этой стадии – создание оптимальных условий для развития продуцента и максимально возможного биосинтеза антибиотика.

2 стадия – стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток (мицелия) микроорганизма и фильтрации (отделение культуральной жидкости от биомассы продуцента)

3 стадия - выделение и очистка антибиотика

4 стадия - стадия получения готовой продукции, изготовление лекарственных форм, расфасовка.

Выделение и очистка антибиотиков – сложный и многостадийный процесс. Концентрация антибиотика в исходной культуральной жидкости не превышает 1%. Цель химической очистки – извлечение антибиотика из культуральной жидкости или из клеток продуцента, концентрирование его и очистка от сопутствующих примесей. При этом необходимо учитывать довольно высокую лабильность многих антибиотиков, их инактивацию при нагревании, растворении в сильно кислых или щелочных средах. От чистоты антибиотика зависит качество фармацевтического препарата и его стоимость. Часто выделение и очистка антибиотика более длительный и дорогостоящий процесс, чем его микробиологическое получение.

При разработке метода выделения антибиотика следует учитывать следующие его свойства

1) преимущественная локализация антибиотика (культуральная жидкость или клетки - мицелий гриба)

2) химическое строение антибиотика

2) гидрофобность антибиотика

3) полярность антибиотика

4) заряд антибиотика при различных рН среды

5) лабильность антибиотика.

Таблица 1.

Химические структуры некоторых антибиотиков

№	Название	Химическая формула
1	Бензилпенициллин Benzylpenicillin-
2	Эритромицин – Erythromycin
3	Стрептомицина сульфат - Streptomycin Sulphate
4	Нистатин - Nystatin

Для выделения антибиотиков используются следующие методы: фильтрация, экстракция водой или органическими растворителями, центрифугирование, сепарирование, хроматографические методы (ионообменную хроматографию). Для концентрирования используют мембранную фильтрацию и лиофильную сушку в вакууме. Для стерилизации – ионизирующее облучение или фильтрацию.

В процессе развития микроорганизмов антибиотики в большинстве случаев выделяются из клеток в окружающую среду. Иногда в культуральную среду выделяется лишь часть антибиотика (часть – в клетках), бывают случаи, когда весь антибиотик полностью содержатся в клетках продуцента.

На стадии предварительной обработки применяют разные методы извлечения антибиотика в зависимости от того, где сосредоточен антибиотик, Если антибиотик в культуральной жидкости, его экстрагируют органическими растворителями, осаждают в виде нерастворимого соединения или сорбируют ионообменными сорбентами. Выделение антибиотика из клеток осуществляют с помощью экстракции органическим растворителем. Если антибиотик – и в культуральной жидкости, и в клетках, выбирают специфический растворитель для осаждения или экстракции антибиотика. Например, изменяя рН культуральной жидкости, тетрациклин экстрагируют в водную фазу. Иногда, наоборот, растворенный и связанный с мицелием антибиотик объединяют в общем осадке, из которого затем экстрагируют антибиотик.

Отделение нативного раствора от биомассы клеток осуществляют методом фильтрации, центрифугирования или сепарирования (при вращении барабана сепаратора благодаря центробежной силе твердые частицы устремляются к стенкам барабана и осаждаются там, а отсепарированная жидкость движется к центру барабана и поднимается вверх в специальную камеру).

Цель химической очистки – извлечение антибиотика из культуральной жидкости или клеток продуцента, его концентрирование, отделение от сопутствующих примесей и получение высокоочищенного препарата, пригодного для применения.

Основными методами очистки антибиотиков являются следующие.

Экстракция. В целях очистки антибиотик многократно переводят из одного растворителя (гидрофильный - вода) в другой (гидрофобный). Если в одном из растворителей антибиотик осаждается, процесс называют перекристаллизацией.

Принцип экстракции органическим растворителем используется при очистке таких важнейших антибиотиков, как пенициллин и эритромицин. При переходе в органический растворитель соответствующие антибиотики освобождаются от полярных примесей, растворимых в воде. Варьируя рН и меняя таким образом растворимость антибиотика в воде (точнее, в буферном растворе), можно многократно переводить антибиотик из одной фазы в другую, освобождаясь каждый раз от определенного количества примесей.

Один из примеров окончания процесса при экстракционном методе выделения и очистки - извлечение пенициллина из органического растворителя бутилацетата, где он находится в виде свободной кислоты: к бутилацетату добавляют насыщенный водный раствор ацетата калия. Выпадает калиевая соль пенициллина. Кристаллы промывают бутанолом и высушивают.

Также при очистке антибиотиков широко используются хроматографические методы, основанные на избирательной сорбции за счет зарядов молекулы антибиотика.

Особое значение имеют сорбционные методы в выделении аминогликозидных антибиотиков (стрептомицина).

Следует отметить, что аминогликозиды – полярные соединения, мало растворимы в органических растворителях, так что использовать экстракционный метод для их очистки нельзя. Антибиотик стрептомицин - сильно полярное органическое основание. Гуанидиновые группы в стрептидиновой части молекулы и метиламинная группа в N-метилглюкозаминновом фрагменте молекулы стрептомицина обуславливают сильные основные свойства этого антибиотика. Для очистки стрептомицина применяют отрицательно заряженные катиониты (сополимеры акриловой или метакриловой кислот и дивинилбензола) в натриевой форме. Раствор стрептомицина пропускают через ряд колонн, заполненных катионитом. Стрептомицин сорбируется, а примеси не связываются с ионообменником. Десорбция раствором серной кислоты позволяет получить стрептомицина сульфат.

Так использование стрептомицина в качестве лекарственного препарата было ограничено серьезными побочными эффектами – аллергическими реакциями, связанными с наличием гистаминоподобных примесей. Усовершенствование систем очистки привело к снижению таких нежелательных эффектов.

Помимо традиционных экстракционных и сорбционных методов при выделении и очистке антибиотиков все большее значение приобретает комплекс приемов, объединяемых под названием мембранной технологии, основанной на использовании специальных мембран, пропускающих молекулы определенного размера.

После выделения и очистки антибиотика его необходимо высушить, удалить свободную и связанную воду. Для концентрирования препаратов антибиотиков в зависимости от свойств антибиотика используют лиофильную или распылительную сушку. Лиофильная (сублимационная) сушка позволяет упаривать воду при низких температурах (-8, -12°С). При распылительной сушке раствор антибиотика распыляется из форсунок до частиц диаметром 5 - 25 мкм в токе нагретого до 160 °С воздуха. Сушка происходит в течение долей секунды. Затем препарат фасуют в стерильные флаконы с соблюдением условий, гарантирующих стерильность.

К антибиотикам, используемым в медицинской практике, предъявляются высокие требования (степень очистки, стерильность препарата и др.). Биосинтез антибиотиков ведется в асептических условиях, при выделении и получении лекарственных форм также следует избегать контаминации, соблюдать требования асептики, поддерживать в исключительной чистоте технологическое оборудование. Антибиотики, предназначенные для инъекций, должны быть стерильными. Обычно используют метод радиационной стерилизации. Стерилизующая доза в 2,5 Мрад. При этом облученные препараты - большинство антибиотиков (природные и полусинтетические пенициллины, аминогликозиды, тетрациклины и ряд других) сохраняют активность и удовлетворяют фармакопейным тестам.

Исключение составляют полиены, т.е. структуры с сопряженными двойными связями (например, нистатин, который при облучении заметно теряет активность). В этом случае для стерилизацици используют фильтрование через специальные мембраны, не пропускающие микроорганизмы.

Заключительные этапы производства антибиотика – фармакологический контроль (соответствие нормам фармакопейных стандартов качества), расфасовка и упаковка.