Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
БХ учебник Николаев.pdf
Скачиваний:
573
Добавлен:
02.05.2015
Размер:
15.53 Mб
Скачать

Глава 5. Молекулярные механизмы генетической изменчивости

171

молочный скот; с этого времени и могло начаться распространение в популяциях аллеля, который обеспечивал сохранение лактазы у взрослых людей.

Рассмотренные здесь примеры непереносимости лекарственных или пище­ вых веществ представляют группу явлений того же рода, что и наследственная предрасположенность к болезням. Для диагностики наследственных болезней, обусловленных генными мутациями, часто используют ДНК-зонды, аналогично ДНК-диагностике серповидно-клеточной анемии, описанной в начале этой главы.

Мутации и лекарственная устойчивость возбудителей болезней

Важное значение в терапии инфекционных болезней имеет изменчивость бактерий и вирусов. Длительное, в течение нескольких месяцев, применение определенного лекарства нередко приводит к появлению в организме

больного мутантного штамма возбудителя, устойчивого

 

О

 

 

 

 

к этом)' лекарству. Например, при лечении СПИД, вызы­

H3C

C4

 

ваемого вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), ис­

 

С

NH

пользуют азидотимидин — аналог тимидина, содержащий

HC

С .

азидную группу у З'-углеродного атома рибозного цикла

HO— с н ,

' N '

" °

(рис. 5.12). Азидотимидин в организме фосфорилируется

и включается в растущую цепь ДНК вируса с З'-конца. Ho

| / ° \ |

 

дальнейшее удлинение цепи ДНК невозможно, поскольку

C TT

TT С

 

I\T

Т/1

 

у азидотимидина нет гидроксильной группы в З'-положе-

H с —

С H

 

нии (на ее месте — азидная группа). Однако через несколь­

I3'

I2’

 

ко месяцев у некоторых пациентов эффективность дей­

N3

H

 

 

 

 

ствия азидотимидина снижается: появился штамм вируса,

Рис. 5.12. Строение

умеющий отличать тимидин от азидотимидина.

азидотимидина

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Успехи биохимии привели к разработке методов, позволяющих манипулировать генами с целью изменения генотипа, а следовательно, и фенотипических призна­ ков организма. Это направление исследований получило название генной инже­ нерии. Основная цель таких исследований — научиться исправлять наследствен­ ные дефекты генома, т. е. лечить наследственные болезни, а также создавать этим методом новые фенотипы путем прямой пересадки генов из одного организма в геном другого. Первые успехи генной инженерии связаны с получением новых форм микроорганизмов, синтезирующих полезные для человека продукты, в том числе лекарственные вещества.

Процедура пересадки гена включает следующие операции:

1)выделение гена;

2)получение рекомбинантной (гибридной) ДНК;

3)введение рекомбинантной ДНК в клетку (получается рекомбинантная клетка);

4)клонирование (размножение) рекомбинантной ДНК (рекомбинантных клеток).

172

Часть I. Строение информационных молекул и матричные биосинтезы

Выделение гена

Для выделения и клонирования (размножения) гена чаще всего применяют поли­ меразную цепную реакцию (см. гл. 4). Еще один метод — синтез ДНК (гена) с ис­ пользованием обратной транскриптазы. Напомним, что этот фермент есть в час­ тицах некоторых РНК-содержащих вирусов. Обратная транскриптаза катализиру­ ет синтез ДНК, используя в качестве матрицы РНК:

РНК

Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты -* ДНК + H4P2O7

Если при реакции in vitro с этим ферментом добавить в инкубационную смесь определенную мРНК (например, мРНК интерферона), то синтезируется ген, ком­ плементарный этой мРНК, в котором закодирована структура соответствующего белка (например, интерферона). Многие индивидуальные РНК удается выделить из сложной смеси разных мРНК клетки и использовать для синтеза генов. Однако при этом методе получается, собственно, не ген, а так называемая комплементар­ ная ДНК (кДНК): она отличается от гена тем, что не содержит интронов, посколь­ ку при созревании мРНК участки, соответствующие интронам, удаляются.

ДНК, синтезированную с применением обратной транскриптазы, можно амплифицировать методом ПЦР.

Получение рекомбинантной ДНК

Ген нужно ввести в клетку таким образом, чтобы он не был разрушен клеточными нуклеазами, а интегрировался с геномом клетки. Для этого in vitro ген соединяют с определенной ДНК, выполняющей роль проводника (вектора). Часто в качестве вектора используют плазмиды — небольшие кольцевые молекулы ДНК, содержа­ щие несколько генов. В исследованиях по генной инженерии часто используют

Рис. 5.13. Получение рекомбинантной ДНК:

плазмида (1) и ДНК (2), содержащая ген, выбранный для пересадки; ломаной линией отмечены места разрезания рестриктазами. После об­ работки рестриктазами образуются плазмидная ДНК (3) и ген (4) с «лип­ кими» концами. При смешивании они соединяются, образуя рекомби­ нантную ДНК (5)

Глава 5. М олекулярные механизмы генетической изменчивости

1 7 3

кишечную палочку Е. coli. Геном этой бактерии представлен одной хромосомой (молекулой ДНК), прикрепленной к мембране, и плазмидами, «плавающими» в цитозоле. Плазмида представляет собой кольцевую ДНК; она примерно в 1000 раз меньше основной молекулы ДНК. В клетке может быть несколько разных плаз­ мид, и каждая из них может быть представлена большим числом копий (до не­ скольких сотен). Репликация плазмид происходит независимо от репликации ос­ новного генетического материала. Н екоторы е плазмиды могут включаться в хромосому и снова отделяться от нее. Плазмиды могут переходить из одной бак­ териальной клетки в другую при конъюгации клеток.

Для получения рекомбинантной ДНК плазмиды выделяют из Е. coli и удаляют из них часть кольцевой молекулы ДНК (рис. 5.13). Для этого применяют рестрик­ тазы. Комплементарные цепи молекулы ДНК разрезаются в разных местах, в ре­ зультате чего образуются «липкие» концы — неспаренные участки цепей, способ­ ные присоединять комплементарные им полинуклеотиды. На фрагменте ДНК, выбранном для пересадки, тоже создают «липкие» концы, используя ту же рестриктазу, и, следовательно, на фрагменте ДНК образуются «липкие» концы, комп­ лементарные «липким» концам рестриктированной плазмиды. Если теперь сме­ шать фрагмент ДНК (ген) и плазмиду, то они соединятся «липкими» концами (см. рис. 5.13). Затем с помощью фермента лигазы образуют фосфодиэфирнуЮ связь между концевыми нуклеотидами обеих молекул, и вновь получают кольцевую моле­ кулу ДНК, но теперь она вместе с плазмидной ДНК содержит ген, выбранный для пересадки. Это и есть рекомбинантная ДНК, т. е. ДНК, содержащая новую комби­ нацию последовательностей (или генов), такую, какой прежде в природе не было.

Клонирование рекомбинантной ДНК

Описанная выше процедура сложна и позволяет получать лишь очень небольшие количества рекомбинантной ДНК (рекомбинантных плазмид). Клонирование — это способ накопления, амплификации рекомбинантной ДНК.

Если к кульгуре Е. coli добавить рекомбинантные плазмиды, то они при опре­ деленных условиях включаются в бактериальные клетки — получаются рекомби­ нантные бактерии (рис. 5.14). Плазмиды в клетке начинают реплицироваться. При размножении бактерий вновь образующиеся бактериальные клетки тоже со­ держат эти плазмиды. Из рекомбинантных бактерий можно выделить клонирован­ ные рекомбинантные плазмиды, а из них — исследуемый фрагмент ДНК: для этого рекомбинантные плазмиды обрабатывают той же рестриктазой, с помощью кото­ рой они были созданы (см. рис. 5.13). Таким путем можно выделить ген или любой другой фрагмент ДНК в количествах, достаточных для исследовательских целей. Отметим, что этот результат вполне подобен результату, получаемому при исполь­ зовании ПЦР: и в том и в другом случае происходит накопление исследуемой ДНК; по этой причине ПЦР часто называют молекулярным клонированием ДНК.

Применение рекомбинантных клеток для синтеза лекарственных веществ

Микроорганизмы — очень удобный объект для промышленного получения многих природных продуктов: они быстро размножаются (биомасса может удваиваться

1 7 4

Часть I. Строение информационных молекул и матричные биосинтезы

Рекомбинантная

плазмида

Размножение

•*-

рекомбинантных

бактерий

 

Выделение

 

плазмид

 

 

Размножение бактерий в условиях,

 

когда возможна экспрессия

 

клонированного гена

Выделение

Выделение

клонированного

белка

гена

 

Для библиотеки ДНК

Для применения в качестве

и для экспериментальных

лекарств и для эксперимен­

целей

тальных целей

Рис. 5.14. Клонирование ДНК в бактериальных клетках

всего за полчаса), процессы выращивания и обработки биомассы технологичны, поддаются автоматизации. С развитием генной инженерии и техники рекомбинан­ тных микроорганизмов появилась возможность заставить микроорганизмы синте­ зировать нужные человеку вещества, которые получить другими методами сложно (см. рис. 5.14). Например, интерферон для применения в качестве лекарства преж­ де получали либо из лейкоцитов крови человека, либо из культуральной жидкости, в которой выращивают клетки человека, синтезирующие этот белок. Такие мето­ ды очень дороги и не позволяют получать достаточные количества лекарства.

Если ввести в клетки Е. coli плазмиду, содержащую ген интерферона человека, то они начинают продуцировать интерферон — белок, который природные штам­ мы бактерии не синтезируют. В настоящее время методами генной инженерии созданы также микроорганизмы, синтезирующие человеческие гормоны инсулин (рис. 5.15), соматостатин, соматотропин, фермент урокиназу, некоторые факто­ ры свертывания крови и др. Все эти белки применяются для лечения болезней.

Глава 5. М олекулярные

механизмы генетической изменчивости

1 7 5

 

«Ген»

«Ген»

 

Вектор

цепи А

цепи В

 

Щ 2 ) (Щ 5

Вектор

Бактериальная

 

хромосома

Цепь А

NH2-EP -T - COOH

NH2-I— Ц

COOH

Цепь В

Инсулин

Рис. 5.15. Получение рекомбинантного человеческого инсулина

Трансгенные животные

Плазмиды можно ввести не только в бактериальные клетки, но и в клетки эука­ риот. При этом плазмиды могут включаться в геном (в хромосомы) клетки и фун­ кционировать в качестве матрицы; следовательно, клетки будут синтезировать белки, закодированные в генах плазмиды. Клетка, содержащая рекомбинантную ДНК, называется трансформированной, если речь идет о бактериальной клет­ ке, или трансфектной — в случае эукариотических клеток.

В одном из вариантов подобной процедуры использовали рекомбинантную ДНК, содержащую промотор (3-лактальбумина (рис. 5.16). Этот промотор обеспе­ чивает транскрипцию гена (3-лактальбумина — одного из белков молока. Ho если

Ген фактора IX человека

Рис. 5.16. Рекомбинантная плазмида с промотором (З-лактальбумина и геном фактора IX человека

1 7 6

Часть I. Строение информационных молекул и матричные биосинтезы

его соединить с другим геном (например, с геном фактора IX — белка, участвую­ щего в свертывании крови), то промотор будет включать транскрипцию этого гена и синтез соответствующего белка. Рекомбинантную плазмиду с промотором

р-лактальбумина и геном человека вводят в яйцеклетку овцы (путем инъекции), и яйцеклетку имплантируют в матку овцы; некоторые особи из ее потомства будут содержать в своем геноме ген человека (трансгенные животные). Трансгенные животные синтезируют белок, кодируемый геном человека; поскольку промотор р-лактальбумина функционирует только в молочной железе, а в других органах он неактивен, то белок, кодируемый геном человека (например, фактор IX), синте­ зируется в молочной железе и секретируется с молоком. Синтезированный белок выделяют из молока трансгенных овец.

Часть II

Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.

Оставленные комментарии видны всем.