Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
БХ учебник Николаев.pdf
Скачиваний:
561
Добавлен:
02.05.2015
Размер:
15.53 Mб
Скачать

Глава 3. Строение нуклеиновых кислот

1 0 5

Межнуклеотидная 3',5'-фосфодиэфирная связь гидролитически расщепляется нуклеазами. Это большая группа ферментов, различающихся по специфичности. Есть нуклеазы, гидролизующие как РНК, так и ДНК, есть такие, которые расщеп­ ляют только РНК (РНКазы) или только ДНК (ДНКазы). Одни из них отщепляют только концевые нуклеотиды (экзонуклеазы), другие гидролизуют внутренние связи (эндонуклеазы). Используя определенный набор нуклеаз, можно гидролизо­ вать нуклеиновые кислоты до нуклеозидмонофосфатов — мономеров нуклеино­ вых кислот. При этом в гидролизате РНК обнаруживается четыре типа рибонуклеозидмонофосфатов, а в гидролизате ДНК — четыре типа дезоксирибонуклеозидмонофосфатов (см. табл. 3.1). Азотистые основания мономеров РНК и ДНК в трех случаях совпадают, а в одном — различны: УМФ (основание урацил) — в РНК, ТМФ (основание тимин) — в ДНК.

Таким образом, нуклеиновые кислоты представляют собой линейные полиме­ ры нуклеозидмонофосфатов, полинуклеотиды. Концы полинуклеотида различа­ ются по структуре: на одном конце имеется свободная Б'-фосфатная группа (5'- конец), на другом — свободная З'-ОН-группа (З'-конец).

Разные ДНК отличаются друг от друга числом мононуклеотидных остатков в молекуле, нуклеотидным составом и порядком чередования нуклеотидных остат­ ков (фактически оснований, поскольку пентозофосфатные части у всех мономе­ ров одинаковы). Так же отличаются друг от друга разные РНК. Для краткого изоб­ ражения первичной структуры нуклеиновых кислот пользуются однобуквенными символами нуклеозидов: А — аденозин, G — гуанозин, С — цитидин, U — уридин, T — тимидин. Первичная структура РНК может быть представлена, например, та­ кой записью:

AUAAGUCCUA...

Запись структуры ДНК отмечается приставкой «д» (дезокси-):

д(GGGATATTGА...)

Эти две записи, помимо символа «д», различаются еще тем, что в первой (РНК) не встречается символ Т, а во второй (ДНК) не встречается символ U.

При такой записи предполагается, что слева находится 5'-конец, справа — З'- конец. Иногда приходится писать полинуклеотиды противоположным образом; в этом случае во избежание путаницы вводят дополнительные приставки: (5'-3') AUAAG... — здесь '/-конец слева; или (3'-5') GAAUA..., 5'-конец справа.

Из четырех разных нуклеотидов можно построить огромное количество нук­ леиновых кислот, различающихся по первичной структуре. В этом отношении нуклеиновые кислоты сходны с белками.

ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА ДНК

Особенностью нуклеотидного состава ДНК является то, что число адениловых нуклеотидов равно числу тимидиловых, а число гуаниловых нуклеотидов равно числу цитидиловых: А = Т, G = С; следовательно, A + G = T + С, т. е. число пурино­ вых нуклеотидов равно числу пиримидиновых (правила Чаргаффа). Такие соот­ ношения не свойственны РНК.

106

Часть I. Строение информационных молекул и матричные биосинтезы

Исходя из правил Чаргаффа о нуклеотидном составе ДНК и из рентгенострук­ турных исследований, Дж. Уотсон и Ф. Крик (Великобритания) предложили модель строения ДНК (1953 г.). Ниже сформулированы основные черты этой модели.

1.Молекула ДНК построена из двух полинуклеотидных цепей, ориентирован­ ных антипараллельно и на всем протяжении связанных друг с другом водо­ родными связями (каждый из мононуклеотидов участвует в образовании водородных связей) — рис. 3.7.

5'-конец

 

 

 

З'-конец

X**

 

.

т

3 '? »

5'

ЪХ

ъ

---------------G -

С ------------

' У

'-

г

г

3 - > ^ 5 '

 

----------

с -

G ----------

s S

y

 

-----------

а ... T ---------

X

:

 

х

 

 

З'-конец

 

 

 

5'-конец

Рис. 3.7. Схема фрагмента молекулы ДНК. Горизонтальные линии обозначают дезоксирибозные остатки, косые линии — 3',5'-фосфодиэфирные связи

2.Водородные связи между цепями образуются за счет специфического взаи­ модействия аденинового остатка одной цепи с тиминовым остатком другой цепи (пара А«»Т) и гуанинового остатка одной цепи с цитозиновым остат­ ком другой цепи (пара G«*C) — рис. 3.8.

 

 

^ H

HX

 

 

 

 

CH3

О ----- H— N

 

N— H

............ О

..

 

\ L /

//6

5л 9 *

r - l

 

V

^

t i

/ / 5

6 \

 

 

/ 6

5 \\

9 J t

<1

 

н ----------NJ2

3 > А

2*n - .........

н— n ^2

зУ ^ Л

'О

H>“N 4

M/

О ............

H ---N

 

 

 

 

 

 

 

 

\H

 

 

тимин

аденин

цитозин

 

гуанин

Рис. 3.8. Комплементарные пары нуклеотидов

Основания, образующие пару, комплементарны друг другу в том смысле, что между ними легче возникают водородные связи, чем при других сочетани­ ях (например, А и G, А и С и др.); это объясняется геометрией расположе­ ния групп, участвующих в образовании водородных связей между парами оснований, и геометрией молекулы ДНК в целом.

3.Первичная структура одной цепи молекулы ДНК комплементарна первичной структуре другой цепи. Это легко понять, рассматривая следующую схему:

(5 ’ —> 3') А— Т— Т— С— Т— С— G— Т—С— G— G

(3* —> 5‘) Т— A— A— G— A— G - С— A— G— С— С

Глава 3. Строение нуклеиновых кислот

1 0 7

Если в полож ении п (считая с 5'-конца) первой цеии находится остаток дезоксиадениловой кислоты (А), то в положении п (считая с З'-конца) второй цепи находится комплементарный ему остаток тимидиловой кислоты (T), а не какой-либо иной мо­ номер. Таким образом, если известна пер­ вичная структура одной цепи молекулы ДНК, то первичная структура другой цепи легко может быть написана исходя из пра­ вил комплементарности оснований и комплементарности цепей.

Следует отметить, что комплементарность цепей не означает идентичности их пер­ вичных структур: например, в приведен­ ной выше молекуле первая цепь содержит три остатка тимидиловой кислоты, а вто­ рая — только два; в первой цепи есть трой­ ка нуклеотидов с последовательностью С— Т—С, а во второй цепи такой тройки нет.

4.Обе цепи закручены в спираль, имеющую общую ось; цепи могут быть разделены только путем раскручивания (такие спира­ ли называют гшектонемическими). Пури­ новые и пиримидиновые основания нукле­ отидов обращены внутрь спирали (см. рис.

3.7и 3.9). Плоскости оснований перпенди­ кулярны к оси спирали и параллельны друг другу, так что получается стопка основа­ ний. Между основаниями в этой стопке возникают гидрофобные взаимодействия, вносящие основной вклад в стабилизацию двойной спирали, больший, чем водород­ ные связи между цепями. Рибозофосфатные части располагаются по периферии, образуя ковалентный остов спирали.

Рис. 3.9. Двойная спираль ДНК

Структура ДНК позволяет объяснить молекулярный механизм фундаменталь­ ных биологических явлений, таких, как самовоспроизведение организмов, наслед­ ственность, изменчивость. Поэтому 1953 год, когда Ф. Крик и Дж. Уотсон разра­ ботали модель строения ДНК (статья в английском журнале Nature заняла одну страницу), принято считать годом рождения молекулярной биологии.

Методы изучения ДНК

Для выделения ДНК из экстракта тканей белки экстракта разрушают протеазами, ДНК осаждают этанолом и осадок растворяют в буферном растворе. Как уже

1 0 8

Часть I. Строение информационных молекул и матричные биосинтезы

отмечалось, молекулы ДНК имеют очень большие размеры: молекула среднего раз­ мера из клеток человека содержит примерно 150 млн нуклеотидных пар, ее длина равна 4 см, отношение длины к толщине равно 3106 (толщина двойной спирали ДНК 20 нм). Такие молекулы очень чувствительны к сдвиговым усилиям, возника­ ющим в растворе, поэтому в процессе выделения из тканей ДНК фрагментирует­ ся, и получаются молекулы размером в тысячи-десятки тысяч нуклеотидных пар. Таким образом, каждая молекула среднего размера распадается на 15 000-150 000 фрагментов. Ho и такого размера молекулы неудобны для исследования, и их при­ ходится фрагментировать дополнительно.

Рестриктазы

Для фрагментирования ДНК обычно используют ферменты рестриктазы, выделя­ емые из бактерий. В отличие от других ДНКаз, рестриктазы узнают определенную нуклеотидную последовательность в двухцепочечной молекуле ДНК, часто из че­ тырех или шести нуклеотидных пар, присоединяются к ней и гидролизуют по од­ ной 3',5'-фосфодиэфирной связи в каждой из цепей в области этих последователь­ ностей. Разные рестриктазы узнают разные последовательности (рис. 3.10), и с по­ мощью набора рестриктаз можно разрезать молекулу ДНК на фрагменты желаемой длины и в местах, выбранных экспериментатором.

H p a /

H in d ///

Рис. 3.10. Последовательности нуклеотидов в ДНК, узнаваемые некоторыми рестриктазами

Для изучения первичной структуры удобны фрагменты размером около 300 нуклеотидных пар, и, следовательно, молекулу ДНК длиной в 150 000 000 нуклео­ тидных пар нужно разрезать на 500 000 фрагментов, и каждый из них изучать от­ дельно. Для многих других исследований требуются и гораздо более короткие, и гораздо более длинные фрагменты.

Разделение фрагментов ДНК

Разделение фрагментов проводят методом электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле. ДНК содержит отрицательно заряженные фосфатные группы, и поэтому в электрическом поле фрагменты перемещаются в направлении положи­ тельного электрода. Скорость перемещения зависит от размера фрагмента: чем

Глава 3. Строение нуклеиновых кислот

1 0 9

меньше размер, тем быстрее движется фрагмент. При определенных условиях уда­ ется разделять фрагменты, различающиеся по длине только на один нуклеотид. Специальные методы окрашивания позволяют сделать видимыми зоны (полосы) разделенных фрагментов (рис. 3.11).

Устройство прибора для электрофореза — см. рис. 1.34.

Рис. 3.11. Электрофорез в полиакриламидном геле смеси фрагментов ДНК:

а — раствор образцов ДНК вносят в выемки («колодцы»), расположенные у края пластины геля, со стороны отрицательного электрода, и включают ток. Фрагменты ДНК каждой пробы движутся в сто­ рону положительного электрода с тем большей скоростью, чем меньше размер фрагмента; б — че­ рез определенное время гель извлекают из прибора для электрофореза и обрабатывают красителем, реагирующим с ДНК: зоны фрагментов ДНК становятся видимыми

ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ РНК

Как уже упоминалось, каждая клетка содержит небольшое число молекул ДНК, по одной гигантской молекуле на каждую хромосому. Размеры молекул РНК гораздо меньше, от нескольких десятков до нескольких тысяч нуклеотидов. РНК отлича­ ются большим разнообразием молекул. Содержание РНК в клетках в 5-10 раз больше, чем ДНК. По особенностям структуры и функций различают три основ­ ные типа РНК:

I.Рибосомные РНК (рРНК) — компоненты рибосом (см. ниже). Н а долю рРНК приходится около 80 % всей РНК клетки. Имеется три вида рРНК: 28S-pPHK (молекулярная масса около 1,5 млн, примерно 4000 нуклеотидных остатков); 18S-pPHK (молекулярная масса около 700 000; 5S-pPHK (молеку­ лярная масса около 30 000, примерно 100 нуклеотидных остатков).

Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.

Оставленные комментарии видны всем.