Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
БХ учебник Николаев.pdf
Скачиваний:
579
Добавлен:
02.05.2015
Размер:
15.53 Mб
Скачать

Глава 2. Ферменты

83

Концентрация фермента в реакционной смеси значительно ниже концентра­ ции субстрата. В этих условиях устанавливается стационарная концентрация ком­

плекса ES, т. е. V ,

=V ; следовательно,

 

1

обр

pacir

 

 

 

A1flE]0-[ESlXS]= (*..,+A2)[ES].

(6)

После преобразования получаем

 

 

 

 

[S ]([E l,- [E S ]) _ t_ ,+ i2 _ „

 

 

 

[ES]

=

(7)

Решая относительно [ES], получаем

 

 

 

 

грет

[E]Q[S]

 

 

 

 

+ И '

(8)

Подставляя в это уравнение значения [ES] из уравнения (2) и [Е]0 из уравне­ ния (3), получаем уравнение Михаэлиса—Ментен:

V = / ™ J S]

(9)

+[S]

В большинстве реакций в организме участвует не один, а два субстрата, напри­ мер А + В *-*С + D. Взаимодействие фермента с каждым из субстратов характеризу­ ется собственной константой Km. Ее определяют по зависимости скорости реак­ ции от концентрации данного субстрата при постоянной (обычно насыщающей) концентрации второго субстрата.

Мы рассмотрели простейший случай ферментативной реакции. В действи­ тельности промежуточных стадий может быть больше, и все они могут быть обра­ тимыми:

E + S Л ES Л EX Л EY Л ... Л EP Л E + P

Кроме того, возможны и другие, параллельно протекающие реакции образо­ вания некоторых промежуточных продуктов. Ho и в таких случаях уравнение Михаэлиса—Ментен оказывается справедливым, только Ku представляет собой более сложную функцию констант скорости частных реакций.

KM и У акс — важные характеристики фермента. Их можно определить по ре­ зультатам измерения v при разных концентрациях S, как указано на рис. 2.17, а. Более точный результат дает метод Лайнуивера—Бэрка. Уравнение ЛайнуивераБэрка представляет собой обратное уравнение Михаэлиса—Ментен:

I

KM +[S] _

KM I |

I

V

Vm JS]

VJIKC [S]

Кыакс-

График зависимости l / v от I / [S] — это прямая с наклоном Ku/ V4altc, отсекаю­ щая на оси ординат отрезок I / У акс (рис. 2.17, б).

Единицы ферментативной активности

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента име­ ет линейный характер (рис. 2.17, в). Поскольку в большинстве случаев количество

84

Часть I. Строение информационных молекул и матричные биосинтезы

фермента невозможно измерить в абсолютных величинах (например, в граммах), то приходится пользоваться условными единицами, основанными на линейной зависимости скорости реакции от количества фермента.

За единицу фермента (E) принимают такое его количество, которое катализи­ рует превращение I мкмоль вещества за I мин. Число единиц фермента в тканях определяют по формуле

количество превращенного субстрата, мкмоль _ n g

навеска ткани, г х время инкубации, мин

Например, для определения лактатдегидрогеназы было взято 100 мг ткани печени, эту навеску инкубировали в течение 15 мин в растворе субстрата и обна­ ружили, что образовалось 210 мкмоль продукта; следовательно, в печени содер­ жится 210 : (0,1 х 15) = 140 единиц лактатдегидрогеназы на I г печени.

Часто находят удельную активность фермента: она равна числу единиц фер­ мента в образце, деленному на массу белка (в мг) в этом образце. Например, если в I г ткани печени содержится 140 единиц лактатдегидрогеназы и 200 мг белка, то удельная активность лактатдегидрогеназы в печени равна: 140/200=0,7 (мкмоль/ мин)/мг. Удельной активностью особенно часто пользуются при очистке фермен­ тов: по мере удаления посторонних белков доля выделяемого фермента в препа­ рате увеличивается, следовательно, возрастает удельная активность (табл. 2.4; см. также табл. 1.9). По возрастанию удельной активности оценивают эффективность отдельных стадий очистки.

Таблица 2.4. Очистка гистидазы печени

 

 

О бщ ая

 

У д е д ы эд

 

 

 

Q fo m

к о н ц е ш -

 

 

 

 

 

активность.

В ы ход,

С'iciicnt.

(.'ltLlllfl OllIIClкИ

раствора.

р л ш я

Hncih^

ЕЛ мг

■ ■ ■ ■

U1IiitiKM

 

 

('IC-IKflli

 

 

 

 

 

 

 

Экстракт

' lJS,0

1ЧЛ

44 S

 

100,0

I

Нагревание при 60 °С

680,0

5,6

35,7

6,5

74,0

3

20 мин

 

 

 

 

 

 

Осаждение сульфатом

50,0

27,0

515,4

19,1

72,0

8

аммония 35-75%

 

 

 

 

 

 

насыщения

 

 

 

 

 

 

Хроматография

180,0

0,8

515,4

160,0

65,0

70

на ДЭАЭ-целлюлозе

 

 

 

 

 

 

Хроматография на

63,5

0,4

238,7

597,0

42,5

260

сефарозе 6B-CL

 

 

 

 

 

 

Хроматография на

21,0

0,1

111,6

1116,0

6,6

485

гидроксилапатите

 

 

 

 

 

 

Если имеется очищенный, индивидуальный фермент, то можно измерить его молярную активность: она равна числу единиц фермента в образце, деленному на количество фермента, выраженное в микромолях. Например, если в растворе фумаразы, содержащем 0,002 мкмоль фермента, обнаружено 240 единиц фермен­ та (в мкмоль/мин), то молярная активность фумаразы равна:

Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.

Оставленные комментарии видны всем.