biologia2 / Методы генетики / методы изучения

Галактоземия, относится к группе аномалий обмена углеводов Заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному типу, при этом образуется недостаточное количество галактозо-1-фосфат-

уридилтрансферазы фермента необходимого для расщепления лактозы, в следствии чего в тканях накапливается избыточное количество галактозо-1 фосфата. Характерные симптомы начинают проявляться после первых же кормлений ребенка. Появляется рвота, понос, кровотечения, нарастает желтушность кожных покровов, нарушается функция печени и центральной нервной системы ( развивается умственная отсталость) . Диагностируют это заболевание с помощью определения галактозы в моче или определяют активность галактозо-1 - фосфат-уридилтрансферазы в эритроцитах.

К заболеваниям, относящимся к дефектам обмена липидов являются различные нарушения обмена липопротеидов в крови или сфинголипидозы. Примером сфинголипидоза является идиопатия Тея-Сакса, характеризующаяся прогрессирующей умственной отсталостью, двигательными расстройствами, нарушением функции печени, селезенки, почек и головного мозга. Липопротеиды транспортируют по организму холестерин , поэтому нарушение этого вида обмена может привести к развитию атеросклероза и ишемической болезни сердца. Диагностировать эти состояния можно по повышенному содержанию в крови липопротеидов.

Биохимический метод можно успешно применять не только для постановки диагноза больным людям, но и для выявления гетерозиготных носителей наследственных заболеваний. Например ,при гемофилии у женщины- носительницы снижается время свертывание крови, для более точной диагностики носительства исследуют антитела к гемофилическому глобулину. У носителей аутосомно-рецессивного гена , болезни Тея-Сакса (детской амавротической идиотии) снижается активность фермента гексозамининидазы А. У носителей миопатии Дюшена (рецессивный ген сцеплен с X хромосомой) изменяется уровень активности фермента креатинфосфокиназы. Носителей фенилкетонурии выявляют по повышенному содержанию фенилаланина в крови. При чем перед исследованиями назначают пациенту диету с повышенным содержанием фенилаланина. , повышение фенилаланина наблюдаются у гетерозиготных носителей при стрессовых ситуациях или у женщин во время беременности.

Установление гетерозиготности имеет очень большое значение Оно помогает предотвратить рождение больного ребенка, особенно когда родители являются кровными родственниками.

Чем раньше проведена диагностика, тем раньше можно начинать лечение. Биохимический метод можно использовать еще в пренаталъной диагностике. Например, амниоцентез, который проводят на 15-16 неделе беременности. Полученную амниотическую жидкость и клетки плода исследуют, что позволяет выявить , например, дефекты различных ферментов. С помощью амниоцентеза диагностируются свыше 60 наследственных заболеваний (в том числе фенилкетонурия, болезнь Тея-Сакса, талласемия, серповидно-клеточная анемия и многие другие ),а так же несовместимость матери и плода по эритроцитарным антигенам. При помощи амниоцентеза можно выявить у плода различные дефекты нервной трубки. В околоплодной жидкости и в сыворотке крови матери повышается уровень (АФП) альфа-фетопротеина.Если врачи выявляют серьезную патологию плода , которая может проявится у ребенка тяжелейшими умственными и физическими аномалиями , они могут рекомендовать прервать такую беременность. Дальнейшая тактика будет определятся совместно с родителями, в зависимости от полученных результатов обследования.Цитогенетический метод.Цитогенетический метод широко стал применятся в генетике человека с 1956 года , когда было определено в кариотипе человека содержится 46 хромосом. Этот метод основан на изучении структуры и количества хромосом в норме и при патологии с использованием микроскопической техники. Применение данного метода делает возможным изучение хромосомных болезней человека, диагностику врожденных болезней ( фенокопий) и исследование закономерностей мутационного и эволюционного процессов.Кариотип человека в норме представлен 46 хромосомами или 23 парами. Из них 22 аутосомы и являются одинаковыми для мужчин и женщин , а одна пара гетерохромосомы у женщин XX , а у мужчин ХУ хромосомы. По положению центромеры и размерам все хромосомы разделены на 7 групп, согласно Денверской классификации. Однако эта классификация не позволяет индивидуализировать каждую хромосому. С применением в конце 60-х годов метода Касперсона (метода дифференциального окрашивания хромосом), стало возможным выделять индивидуальный рисунок каждой хромосомы в следствии того, что участки эухроматина и гетерохроматина в хромосоме по разному окрашиваются флюоресцирующими и нефлюоресцирующими красителямиПрименение цитогенетического метода показано:при наличии у пациента множественных врожденных пороков неясной этиологии. при подозрении на хромосомные или геномные болезни, для окончательного диагноза

для анализа кариотипа у супругов , при многократных спонтанных абортах, мертворождениях или наличие в семье детей с врожденной аномалией. . для пренатальной диагностике врожденных аномалий.

для определения полового хроматина , при нарушении репродуктивной функции неизвестной причины.

Материалом для исследования могут служить клетки различных органов и тканей, главное условие чтобы эти клетки находились в митотическом цикле. Чаще всего для изучения хромосомного набора применяют метод Мурхеда. Для этого исследуют лимфоциты периферической крови. Сначала лимфоциты обрабатывают фитогемагглютинином ( ФГА ), чтобы они вступили в митоз, а затем на стадии метафазы добавляют колхицин, разрушают аппарат веретена деления и не допускают расхождения хроматид к полюсам клетки. Для хорошей однородной окраски используют краситель Романовского- Гимзе или применяют дифференциальное окрашивание хромосом. Полученные мазки сначала изучают с помощью микроскопа, визуально. Затем фотографируют и составляют идиограммы или кариограммы. Данные цитогенетических исследований заносят в специальные бланки-протоколы.

Применяя цитогенетический метод можно выявить геномные мутации, связанные с изменением числа хромосом ( все известные моносомии и трисомии по аутосомам и половым хромосомам) , а также хромосомные аберрации , связанные с изменением структуры хромосом ( делецию, дупликацию, транслокацию).

Цитогенетический метод позволяет определять генетический пол организма. Для изучения половых хромосом , в частности У хромосомы, используют специальную краску акрихиниприт (флюорисцирующая ) и исследование проводят в ультрафиолетовом свете.

Чтобы быстро определить изменения числа половых хромосом применяют экспресс-метод определения полового хроматина. Половой хроматин или тельце Барра , представляет собой одну из двух X хромосом, при чем в инактивированной форме. Оно выявляется в виде сгустка треугольной или овальной формы около внутренней мембраны ядерной оболочки. В норме половой хроматин обнаруживается только у женщин. При увеличении числа X хромосом увеличивается и количество телец Барра. При уменьшении числа X хромосом ( синдром Шерешевского -Тернера кариотип 45 ХО) тельце Барра отсутствует. В норме у мужчин половой хроматин не обнаруживается , его наличие может свидетельствовать о синдроме Клайнфельтера ( кариотип 47 ХХ Дерматоглифическин лютод.(«Дерма» - кожа, « глифика»-рисунок), следовательно при помощи дерматоглифического метода можно изучать кожный узор на сгибательной поверхности пальцев, ладонях и подошвах. Пальцевые и ладонные рисунки в норме и патологии хорошо изучены. Еще в 1892 г Гальтоп установил, что пальцевой и ладонный узор являются индивидуальными для каждого человека и не изменяются в течении всей жизни. Гальтон предложил классификацию рельефа кожных рисунков . Позднее эта классификация была дополнена другими учеными и с успехом применяется не только в генетических исследованиях , но и в криминалистики.Дерматоглифика включает несколько разделов : дактилоскопия ( изучение узоров па подушечках пальцев), пальмоскопия ( рисунки па ладонях) и плантоскопия ( изучение подошвенной поверхности стопы).Дактилоскопия . Гребни на коже пальцев • рук соответствуют сосочкам дермы, их называют иапилярпыми линиями , рельеф этих выступов повторяет пласт эпидермиса. Межсосочковые углубления образуют борозды. Закладка узоров происходит на 15-Ь> недели внутриутробного развития. Полностью рисунок формируется к 6 месяцам после рождения и остается неизменным в течении всей жизни

Несмотря на индивидуальную неповторимость узоров , выделяю, I основных типа узоров: петли т. ( один конец узора закруглен и «мкну, другой открыт), дуги А (узор может быть простым плоским или шаровидным, состоит из неперекрывающихся линий), завитки W (узор состоит из концентрических линий). Самыми распространенными являются петлевые узоры, реже всех встречаются дуговые узоры. В популяции встречаются люди, имеющие однотипные рисунки на всех десяти пальцах (только дуги, только завитки, петли) или все разные рисунки.

В настоящее время предложена гипотеза о полигенном определении типа узора на пальцах. Предполагается, что гены формирующие завиток локализованы в хромосомах группы D, петли в хромосомах группы Е, дуги в хромосоме группы G.В настоящее время, установлено модифицирующее влияние генов, находящихся в половых хромосомах. При увеличении числа X хромосом увеличиваются дуги, и снижается завитки. При снижении X хромосом (например, при синдроме Шерешевского-Тернера) характерно увеличение петель.Запись пальцевых узоров может выглядеть следующим образом: Правая рука У правшей более сложные узоры встречаются на правой руке, у левшей на левой. У женщин частота завитковых узоров ниже, чем у мужчин.Для различных этнических групп характерен определенный папилярный узор. Например, у коренных жителей Дона на втором и четвертом пальцах преобладают петли. У жителей Дальнего Востока на пальцах преобладает завиток.Пальмоскопия. Ладонный рельеф очень сложный, в нем выделяют ряд полей, подушечек и ладонных линий. У основания 2, 3, 4 и 5 пальцев находятся пальцевые трирадиусы - точки схождения папилярных линии, их обозначают а, b ,с d. Вблизи браслетной складки (в области лучезапясного сустава), располагается главный осевой ладонный трирадиус t. Если провести линии от грирадиусов а и d к t, получится ладонный угол аdt, в норме он не должен превышать 57. Дерматоглифический метод является наиболее показательным при геномной патологии ( изменение числа хромосом), он менее показателем при хромосомных аберрациях Его можно применять для установления зиготности близнецов, установления отцовства. Тератогенные факторы действующие в эмбриональном периоде могут существенно влить на дерматоглифический комплекс человека. Часто при синдроме Дауна и при перенесенной внутриутробной краснухе наблюдаются сходные изменения узоров.Иммуногенетический метод.Этот метод применяется у пациентов при подозрении на иммунодbabwbnyst заболевания (например, агаммаглобулинемии- почти полное отсутствие глобулинов в крови), при подозрении на несовместимости антигенов матери и плода, для определения наследственного предрасположения к заболеваниям или установления отцовства.

Для диагностики иммунодефицитных состояний исследуют глобулины, Т- и В- лимфоциты , нейтрофилы и макрофаги. Определяют антигены эритроцитов, лейкоцитов и сыворотки крови. Для пренатальной диагностики можно определять НLА- антигены в лейкоцитах человека По этим антигенам можно установить адреногенетальный синдром.( или врожденная дисфункция коры надпочечников, при которой повышается синтез андрогенов в коре надпочечников. У девочек это проявляется ложным гермафродитизмом , а у мальчиков преждевременным половым созреванием )

Иммуногенетические методы достаточно дорогостоящие, но очень эффективные для определения предрасположенности к наследственным заболеваниям или для прогнозирования здоровья будущих детей.Онтогенетический метод.Онтогенетический метод основан на изучении закономерности проявления какого-либо признака или заболевания в процессе индивидуального развития.

Выделяют несколько периодов развития человека: пренатальный и постнатальный. Большинство признаков образуется во время пренатального периода. После рождения заканчивается формирование коры головного мозга, психики, проявляется способность к обучению. Происходит становление иммунной системы.

В различные периоды развития человека происходит изменение активности генов, при чем может наблюдаться как «включение» и «выключение» генов, так и «усиление» и «ослабление» генов.

В постнатальный период, например, происходит экспрессия генов определяющих развитие вторичных половых признаков, развитие наследственных заболеваний (сахарного диабета, близорукости, миопатии Дюшена, и т.д.). В этот же период происходит депрессия многих генов. Репрессируется активности генов, связанных с выработкой меланина (в результате происходит поседение волос). Не происходит синтеза эластазы (вследствие чего появляются морщины), подавляется выработка гамма-глобулинов (полому повышается восприимчивость к бактериальным инфекциям).В старости у человека меняется соотношение женских и мужских полосы гормонов. В результате у мужчин меняется тембр голоса, форма тела, происходит отложение жира по женскому типу, меняется психика - мужчины становятся плаксивыми и впечатлительными. У женщин грубеет голос, меняется фигура.

С возрастом рецессивные гены могут оказывать большее влияние на развитии того или иного признака. У гетерозиготного по генотипу человека, например, по фенилкетонурии изменяется психика

Наряду со «временем действия генов» выделяют и « поле действия генов». В каждой клетке человека, за исключением зрелых половых клеток содержится одинаковый диплоидный набор хромосом и одинаковый набор генов, но в процессе онтогенеза и формирования органов и тканей, одни из генов блокируются, а другие включаются в работу. Так, например, только в клетках щитовидной железы работают гены, отвечающие за синтез гормона тироксина, а в клетках поджелудочной железы гормона инсулина. В клетках других органов тоже есть такие гены, но они блокированы.

У человека в процессе онтогенеза формируется конституция Конституционные признаки тоже имеют сложную генетическую основу . К ним относятся такие признаки структуры, функции или поведения , которые характерны для процессов роста, созревание и старения.

Медицина стала все больше обращать внимание на конституциональные болезни. Оказалось, что люди астенического телосложения более склонны к развитию туберкулеза легких, и, наоборот, у полных людей чаще наблюдается атеросклероз и гипертоническая болезнь.Метод сцепления генов.Согласно закону Т. Моргана гены находящиеся в одной хромосоме наследуются сцеплено , но с другой стороны известно , что во время первого мейотического деления может происходить обмен определенными сегментами гомологичных хромосом. Таким образом , не всегда гены находящиеся в одной хромосоме передаются вместе.

В связи с тем что у человека не возможны прямые эксперименты по скрещиванию , развитие исследований по сцеплению и картированию генов задержалось на несколько десятилетий. Прорыв оказался возможен только благодаря разработки новых методов генетики соматических клеток и особенно гибридизации. Дальнейшие успехи стали возможны с применением методов молекулярной генетики , в частности изучения ДНК зондами. В настоящее время генная карта человека достаточно обширная и число локализованных генов быстро растет.

На первых этапах для изучения сцепления генов анализировали родословные хотя выявления сцепления было сильно затруднено. Простым анализом родословной были определены сцепления генов дальтонизма и гемофилии, генов эллиптоцитоза и генов системы Rh.

В большинстве случаев анализ сцепления намного труднее, особенно когда речь идет о двойных гетерозиготах. В настоящее время для выявления сцепления используется статистический метод « лод-баллов» разработанный Холдейном, Смитом и Мортоном. Принцип этого метода следующий: Сначала определяется вероятность Р 2 того, что имеющиеся данные соответствуют случаю двух несцепленных, свободно рекомбинирующих генов. Затем определяется вероятность Р 1 того , что те же данные соответствуют случаю двух сцепленных генов. Отношение этих двух вероятностей есть отношение правдоподобий, которое выражает шансы за и против сцепления. Существует компьютерная программа LIРЕD, которая дает оценки максимального правдоподобия параметров сцепления на основе данных родословной.

Когда установлено сцепление между несколькими локусами следующий шаг заключается в определении расстояния между этими локусами на генетической карте, которое выражается в морганидах (М). Например, расстояние между локусами Rh фактора и эллиптоцитоза составляют 3 М, между локусом синдрома дефекта ногтей и коленной чашечки локусом групп крови по системе АВО расстояние 10 М, между локусами гемофилии и дальтонизма расстояние 9,8 М.

Установление групп сцепления нельзя определить, пользуясь только анализом родословной. Новый метод картирования, основанный на гибридизации клеток, привел к большим успехам в этой области.Методы изучения генетики соматической клетки и методы изучения ДНК.Все соматические клетки организма содержат полный набор генетической информации, т.е. тотипотентны. Соматические клетки могут служить моделями для изучения наследственности и изменчивости, которые невозможно исследовать на целом организме, и в какой то мере компенсировать гибридологический метод, который не может быть применим в отношении человека. Соматические клетки достаточно быстро растут на питательных средах и поэтому их можно размножить в большом количестве. Культуры соматических клеток получают из материалов биопсий (кожи, опухолевой ткани, ткани эмбрионов, полученные во время амниоцентеза, костного мозга), но чаще всего исследуются клетки периферической крови

В генетике соматических клеток пользуются следующими приемами:I) культивирование, 2) клонирование -получение потомков одной клетки, 3) селекция с последующим отбором, 4) гибридизация соматических клеток.

Благодаря культивированию на питательных средах и клонированию получают достаточно большое количество клеток.Гибридизация соматических клеток основана на слиянии различных культивированных клеток. Первые опыты по гибридизации были проведены в конце 60-х годов на клетках мышей. Оказалось, что частота гибридизации повышалась при введении в клетку инактивированного ультрафиолетом вируса парагриппа Сендай. Этот вирус изменял проницаемость клеточных мембран и повышал способность клеток к слиянию. Образовывались многоядерные клетки гетерокарионы, у которых в общей цитоплазме содержались два родительских ядра. При дальнейшем делении таких клеток получались настоящие гибридные клетки. Они были одноядерные, представляли собой синкарион, у которой в ядре содержались хромосомы обеих родительских клеток.Для гибридизации можно использовать клетки разных людей, а также различных видов. Например, человека и других животных (мыши, крысы, обезьяны). Гибридизация проводится с целью установления групп сцепления, и построить карты хромосом человека.В норме клетки мыши содержат 40 хромосом, у человека 46 хромосом. В 1967 г. Вейс и Грин гибридизовали линии клеток человека и мыши. В гибридных клетках как правило не 86 хромосом, меньше, потому что хромосомы мыши сохраняются полностью, а хромосомы человека постепенно утрачиваются . Хромосомы мыши и человека можно отличить морфологически, кроме того они функционируют самостоятельно и следовательно синтезируются различные белки. Все это позволяет установить синтез каких белков связан с генами, локализованными в конкретных хромосомах. Таким способом можно установить группы сцепления, так как если гены присутствуют или отсутствуют вместе на этом основании можно считать, что они локализованы в одной хромосоме. Гибридные клетки человек- крыса содержат почти все хромосомы человека, у них остается только одна хромосома крысы.

Метод гибридизации соматических клеток позволяет осуществлять.

1. анализ сцепления и локализации генов.

2. изучить первичные продукты в активности отдельных генов.

3. вскрыть механизмы взаимодействия генов и путей реализации генной активности.

4. изучить генные мутации.

5. изучить патогенез ( развитие) наследственнь.х болезней на клеточном и биохимическом уровнях. 6 проводить диагностику наследственных болезней в пренатальном периоде.

Для определения локализации генов необходимы дополнять методы

гибридизации методами идентификации и дифференционального окрашивания хромосом.

Другим методом , используемым для установления локализации гена в хромосоме является использование меченной РНК и ДНК. Установление тесного сцепления с маркером ДНК позволило локализовать гены многих важных наследственных болезней в конкретных хромосомных сегментах.

Достижением молекулярной генетики является методы секвенирования- определения нуклеотидной последовательности ДНК Определены последовательности нуклеотидов генов в и глобиновых цепях гемоглобина , инсулина, пролактина, соматотропина , интерферона, актина и тубулина.

Методика обратной транскрипции ДНК на м РНК и последующим клонированием этой ДНК , привела к появлению ДНК-зондов. Эти зонды используются для гибридизации с ДНК клеток пациента для определения точной локализации генетической мутации.

Для изучения тонкой организации ДНК успешно применяют ферменты рестриктазы ( которые разрезают ДНК на фрагменты в строго определенных местах). Это дает возможность получать относительно короткие фрагменты ДНК, в которых легче определить последовательность нуклеотидов. Отдельные фрагменты ДНК можно затем включать в бактериальные плазмиды , что позволяет получать в дальнейшем большое количество полипептидов. Благодаря таким разработкам генной инженерии стал возможен синтез кишечной палочкой гормонов инсулина и соматотропина.Методы определения генетически обусловленных событий.В медицинской генетике определение вероятности генетически обусловленных событий имеет большое значениеНапример, определение генетической детерминации пола. Все яйцеклетки женщины имеют Х-хромосому. При оплодотворении они окружены большим числом сперматозоидов, половина которых имеет Х-хромосому, а другая половина У-хромосому. Какой из двух типов сперматозоидов сольется с яйцеклеткой - дело случая. Если яйцо будет оплодотворено сперматозоидом с Х-хромосомой , из зиготы разовьется женский организм. если сперматозоидом с У-хромосомой - мужской организм. Так как количество сперматозоидов того и другого типа одинаково, то каждое из этих двух возможных событий равновероятно. Следовательно, в пользу рождения мальчика имеется 1 благоприятный шанс из двух возможных Тоже и в пользу рождения девочки. Отсюда вероятность рождения мальчика равна 0,5 и девочки тоже 0,5.В общей форме вероятность (Р) в ее количественном выражении предоставляет частное от деления числа благоприятных шансов (Р) „а общее число всех шансов ( 8 )В нашем случае, когда Р равно единице , а S двум, Р равно 1/2. Тоже самое можно выразить в процентах:В нашем случае 100 • 0,5 = 50%. По этим формулам в большинстве простых случаев можно вычислить и вероятность рождения ребенка с определенным наследственным признаком.В более сложных случаях при вычислении вероятности генетически обусловленных событий, нужно иметь в виду излагаемые ниже правила. Правило I. Вероятность события не зависит от предшествовавших событий.

Разберем это правило на примере генетической детерминации пола ребенка. В семье А первым ребенком была девочка. Какова вероятность того, что вторым будет мальчик.

Начинающие изучение генетики нередко думают, что так как расщепление детей по полу происходит в отношении 1:1, и первым ребенком в семье А была девочка, значит вторым должен быть мальчик. Статистика доказывает, что это заключение неправильно. Пол второго ребенка, так же как и пол первого, зависит от случая. Численное соотношение сперматозоидов с X - и У-хромосомой, у отца детей после рождения первого ребенка не изменилось и при мейозе возникает равное число сперматозоидов обоих типов. Следовательно, вероятность рождения мальчика при второй беременности, как и при первой, равна 0,5 или 50%, тогда вероятность рождения девочки составляет тоже 0,5.

В семье В. родились две девочки Какова вероятность того, что третьим ребенком будет тоже девочка.Используя то же рассуждение, следует сказать, что так как соотношение сперматозоидов с Х- и У-хромосомой у отца после рождения двух детей не изменилось, то вероятность того, что третьим ребенком будет девочка составляет 50%.

В общем виде рассматриваемое правило выражается так. При двух ичи нескольких независимых событиях, вероятность последующего события не зависит от предыдущих Ле Шателье выразил это в форме афоризма: "Вероятность памяти не имеет".Метод моделирования наследственных заболеваний на лабораторных животных.Применение этого метода стало возможным в связи с внедрением закона Н.И Вавилова о гомологических рядах наследственной изменчивости в практическую медицину. Закон гомологических рядов универсален. Гомологические ряды отмечены у разных отрядов млекопитающих и в том числе у человека. Следовательно, медицина получила возможность использовать животных с гомологическими заболеваниями в качестве моделей для изучения болезней человека, для апробации на них новых методов лечения и новых лекарственных препаратов. Сахарный диабет можно изучать на крысах, катаракту на мышах, крысах и собаках, глухоту на морских свинках. Множество наследственных заболеваний изучают на приматах.Принципы медико-генетического консультирования.

Медико-генетическое консультирование это один из видов специализированной медицинской помощи и может осуществляться лишь специалистом в области медицинской генетики.

В большинстве случаев на консультацию к врачу- генетику направляют уже больных людей для уточнения диагноза. Но более перспективным является так - называемое активное консультирование, когда объектами исследования становятся здоровые люди, но являющиеся родственниками больных с тяжелой формой наследственной патологии. В чанном случае можно выявить предрасположенность к заболеваниям, выявить гетерозиготное носительство и прогнозировать рождения больного ребенка. В медико-генетическом консультировании нуждаются пациенты со стертыми формами наследственных заболеваний и супруги, являющиеся кровными родственниками.