01-10-2014_10-50-07 / лекция 4

ЛЕКЦИЯ 4

ФЕРМЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНОМ КЛОНИРОВАНИИ (продолжение)

ДНК-лигаза фага Т4.

Молекулы ДНК с однонитевыми концами могут объединяться с использованием ферментов ДНК-лигаз. Этот фермент катализирует образование фосфодиэфирной связи в одноцепочных разрывах двухцепочной ДНК между 3´-ОН группой терминального остатка одной цепи и 5´-фосфатной группой другой цепи. Наибольшее применение в ГИ находит ДНК-лигаза фага Т4. Реакция лигирования протекает в два этапа. Фермент требует АТФ как кофактора. Вначале образуется промежуточный комплекс фермент-АМФ (этап 1), после чего остаток АМФ переносится на 5′-фосфатную группу концевого нуклеотида в точке разрыва ДНК (этап 2). Образовавшаяся фосфодиэфирная связь гидролизуется во время нуклеофильной атаки 3´-ОН группы соседнего нуклеотида, что приводит к образованию новой фосфодиэфирной связи, восстанавливающей целостность сахаро-фосфатного остова ДНК. Т4-ДНК—лигаза осуществляет соединение фрагментов двуцепочной ДНК, обладающих комплементарными «липкими» или «тупыми» концами. Как следует из механизма реакции, необходимым условием протекания лигирования является наличие 5′-концевого фосфата и 3′-концевого гидроксила в точках разрыва цепей ДНК. При этом эффективность лигирования по «тупым» концам Т4-ДНК-лигазой возрастает в присутствии Т4-РНК-лигазы, которая осуществляет ковалентное соединение 5′-фосфорилированных концов одноцепочных ДНК или РНК с 3′-ОН группами одноцепочных нуклеиновых кислот.

РИСУНКИ

Обычно сшиваются фрагмент переносимой ДНК с векторной молекулой. Для того чтобы повысить эффективность процесса лигирования, молярное соотношение (в данном случае число молекул), переносимой ДНК и векторной обычно составляет 10. Альтернативная стратегия заключается в использовании фосфатазы теленка для удаления фосфатных групп с 5′-PO₄ –концов линеаризованных векторов ДНК. Поскольку эта фосфатазная группа существенна для сшивания двух концов вектора друг с другом, рециклизация (т.е. снова образование циклической ДНК) векторной молекулы становится невозможной. Однако, когда присутствует переносимая ДНК, ее 5′-PO₄ –группа может использоваться для сшивания с 3′-ОН – концами вектора. Это приводит к образованию циклической молекулы с одной брешью в каждой из нуклеотидных цепей, (которые разделены длинной “passenger” ДНК). Эта структура достаточно стабильна для трансформации в клонирующую клетку, где системы репарации (осуществляющие ремонт и лечение ДНК) заполняют разрыв.

Полинуклеотидкиназа фага Т4 (включение метки в 5´концы ДНК.

Среди других ферментов, используемых в ГИ, следует отметить полинуклеотидкиназы, которые осуществляют фосфорилирование свободных 5'-ОН-концов молекул нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) или их фрагментов с использованием в качестве донора фосфатных групп АТФ или АДФ. Полинуклеотидкиназа фага Т4 широко используется для введения радиоактивной метки в ДНК или РНК с целью получения радиоактивно меченых зондов или секвенирования нуклеиновых кислот.

РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза, ревертаза)

Эти ферменты способны осуществлять синтез ДНК на матрице РНК, используя четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата (dNTP), также как это делают ДНК-зависимые ДНК-полимеразы. Ревертазы, как и ДНК-полимеразы действуют только при наличии затравки. Широко используемая в ГИ ревертаза вируса миелобластоза птиц помимо полимеразной активности обладает 5' → 3' - и 3' → 5' – экзорибонуклеазными активностями и расщепляют РНК в ДНК-РНК гибридах (по процессивному механизму). Ревертазы находят применение в синтезе двухцепочных ДНК , комплементарных РНК (особенно мРНК), для последующего ее клонирования в плазмидных векторах при получении библиотек (клонотек) кДНК. Обратные транскриптазы, подобно ДНК-полимеразам, могут быть использованы для введения радиоактивной или флуоресцентной метки в ДНК-зонды в составе меченых (dNTP).

Было обнаружено, что ревертазной активностью может обладать термостабильная ДНК полимераза из бактерии Thermus thermophilus. Это позволяет использовать ее для прямого обнаружения специфических РНК в биологических образцах методом ПЦР.

Щелочные фосфатазы. Дефосфорилирование ДНК

Щелочные фосфатазы, выделяемые из бактерий или кишечника теленка, катализируют удаление 5´-фосфатных групп ДНК или РНК, а также расщепление макроэргических связей рибо- и дезоксирибонуклеозид-фосфатов. Их используют при подготовке фрагментов нуклеиновых кислот к введению 5´-концевой радиоактивной метки ³²Р, а также для предотвращения лигирования векторных молекул ДНК самих на себя. Как упоминалось выше, ДНК-лигаза способна образовывать фосфодэфирные связи в одноцепочных разрывах лишь при наличии в них 5´-концевого фосфата. Удаление этих фосфатных групп молекул вектора, лианеризованных с помощью одной рестриктазы во время ее подготовки для клонирования соответствующего фрагмента ДНК, предотвращает образование кольцевых молекул вектора (без вставки), а также его олигомеров во время лигирования с клонируемой последовательностью. Необходимые для лигирования со вставкой фосфатные группы содержатся в самих клонируемых фрагментах ДНК, а остающиеся в результате неполного лигирования два одноцепочного разрыва репарируются in vivo после введения вектора со вставкой в бактериальные клетки.

Нуклеазы

Нуклеазы - гидролитические ферменты, расщепляющие нуклеиновые кислоты. По механизму расщепления субстратов они делятся на экзо- и эндонуклеазы. Экзонуклеазы катализируют последовательное отщепление моно- или небольших олигонуклеотидов с концов молекул ДНК или РНК, тогда как эндонуклеазы вносят в молекулы НК внутренние разрывы. К эндонуклеазам относятся многочисленные рестриктазы, рассмотренные нами ранее. Некоторые нуклеазы обладают более широкой специфичностью и могут гидролизовать как РНК, так и ДНК, а также одновременно проявлять обе активности: экзо- и эндонуклеазную. Нуклеаза Bal31 из Alteramonias aspejiana последовательно отщепляет отдельные моно- и олигонуклеотиды с 5´- и 3´-концов двухцепочных ДНК, укорачивая обе цепи ДНК приблизительно с равной скоростью. При этом эта нуклеаза гидролизует и одноцепочную ДНК.

Примеры используемых в ГИ нуклеаз

Экзонуклеаза III E. coli катализирует последовательное отщепление нуклеотидов с 3' концов двухцепочных ДНК в направлении. Мспользуется для получения делеций в клонированных молекулах ДНК.

Фермент обладает эндонуклеазной активностью по отношению к апуринизированной ДНК, активностью РНКазы Н, осуществляющей гидролиз РНК в РНК-ДНК-гибридах, и 3' –фосфатазной активностью.

Экзонуклеаза фага λ катализирует последовательное отщепление 5´- мононуклеотидов в двухцепочных ДНК при наличии в них 5´-концевых фосфатных групп. Ее используют для получения одноцепочных молекул ДНК с целью их последующего секвенирования.

Нуклеаза S1 из Aspergillus orizae специфически расщепляет одноцепочные молекулы ДНК с образованием 5´-фосфорилированных моно- и олигонуклеотидов. Те же свойства присущи и нуклеазе золотистой фасоли (mung bean).

Панкреатическая рибонуклеаза А (РНКаза А) обладает активностью эндорибонуклеазы, специфически расщепляющей фосфодиэфирные связи, образованные пиримидиновыми нуклеотидами (Т и Ц). Продуктами гидролиза являются 3´-фосфорилированные пиримидиновые мононуклеотиды и олигонуклеотиды, содержащие концевые пиримидин-3´-монофосфаты.

Панкреатическая дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I) представляет собой эндонуклеазу, гидролизующую как одно-, так и двухцепочную ДНК с образованием сложной смеси моно- и олигонуклеотидов, содержащих 5´-фосфатные группы. В присутствии ионов Mg²⁺ ДНКаза I независимо атакует каждую цепь ДНК, при этом места разрывов располагаются случайным образом вдоль молекулы, а в присутствии ионов Mn²⁺ расщепляет обе цепи ДНК приблизительно напротив друг друга.

ДНКаза I+ Mg²⁺ ↓ ↓ ↓

nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn → nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

↑ ↑ ↑ ↑

ДНКаза I+ Mn²⁺ ↓ ↓ ↓

nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn → nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

↑ ↑ ↑

Рассмотренные нами ферменты не единственные, из тех, которые применяются в ГИ. О других мы поговорим на следующих лекциях.

------------------------------------------------------------------------------------------------

Март 2005. ООН рекомендовал запретить все способы клонирования человека. Инициаторы - США. 80 стран –за (Россия в т.ч.), 30 – против (Япония, Китай, Англия). Противники клонирования приводили пример несчастной овечки Долли, которая умерла на 3 году жизни.