Опыт 1. Ферментативный гидролиз крахмала. Качественная проба на амилазу

Амилаза – фермент, который расщепляет только крахмал и близкие к нему полисахариды (гликоген) до мальтозы.

1. Наносят на стеклянную пластинку, под которую подложен лист белой бумаги, 2 ряда по 5 капель раствора йода.

2. Наливают в пробирку 5 мл раствора крахмала и 3 мл дистиллированной воды (контрольная проба).

3. В другую пробирку наливают 5 мл раствора крахмала и 3 мл разбавленной слюны.

Приготовление раствора слюны.

Ополаскивают рот обычной водой (по 30-50 мл) и два раза дистиллированной водой. Набирают первую порцию (10-20 мл) дистиллированной воды в рот и держат ее во рту 2 минуты, смешивая во рту со слюной, жидкость выпускают в стаканчик и профильтровывают через марлево-ватный фильтр в отдельную пробирку (или стаканчик).

4. Встряхивают обе пробирки, ставят их в водяную баню при 36-37 С и помещают в них по стеклянной палочке.

5. Через каждые 2-3 минуты (4-5 проб) берут стеклянными палочками из каждой пробирки капли жидкости и наносят их на капли раствора йода на предметном стекле.

Сначала синее окрашивание будет появляться от капель, взятых из обеих пробирок. Затем из пробирки, где есть амилаза слюны, капли будут давать с йодом красно-бурый оттенок. После 5-й пробы (примерно через 20-30 минут) капли жидкости из пробирки со слюной окрашивания более не дают. При этом капли из контрольной пробы все время дают синее окрашивание.

6. Наблюдают наличие опалесценции в контрольной пробе (без слюны) и отсутствие опалесценции во второй пробирке (со слюной).

7. Отдельно проводят реакцию Троммера. Для этого берут по 2 мл в каждую пробирку и добавляют равный объем 10 %-го раствора NaOH. По каплям добавляют 5 %-й раствор медного купороса до появления неисчезающей мути гидроокиси меди. Осторожно нагревают верхнюю часть содержимого пробирки. Появление желтого (гидрат закиси меди), переходящего в красное (Cu₂O), указывает на положительную реакцию Троммера.

8. Отдельно проводят реакцию с фелинговой жидкостью. Для этого к 2 мл исследуемой жидкости добавляют около 1 мл фелинговой жидкости и нагревают. Появление красного осадка закиси меди указывает на положительную реакцию.

Опыт 2. Влияние температуры на активность амилазы слюны

1. 2-3 мл раствора слюны в пробирке доводят до кипения и кипятят 1-2 минуты.

2. Охлаждают до комнатной температуры и добавляют 5 мл раствора крахмала.

3. Встряхивают содержимое пробирки и убеждаются с помощью раствора йода или реакции с фелинговой жидкостью в том, что гидролиз крахмала в пробирке с прокипяченной слюной не произошел, так как фермент в ней разрушился.

Опыт 3. Специфичность действия амилазы и сахаразы

1. Испытывают раствор сахарозы с помощью реакции с фелинговой жидкостью. Если препарат сахарозы х.ч., то реакция будет отрицательной.

2. Наливают в одну пробирку 3-4 мл раствора крахмала, в другую -3-4 мл сахарозы.

3. Добавляют в обе пробирки по ~1 мл разбавленной слюны, встряхивают содержимое каждой пробирки и ставят в водяную баню при 36-37 С на 5–10 минут.

4. С помощью реакции с фелинговой жидкостью убеждаются в гидролизе крахмала и в отсутствии гидролиза сахарозы.

5. Берут еще две других пробирки, в одну наливают 4-5 мл раствора крахмала, в другую – 4-5 мл раствора сахарозы.

6. В каждую пробирку добавляют ~ по 1 мл раствора сахарозы, перемешивают содержимое каждой пробирки и ставят на 10 минут в водяную баню при 36-37 С.

7. Охлаждают содержимое пробирок до комнатной температуры и проводят реакции с фелинговой жидкостью в обеих пробирках. Убеждаются в отсутствии гидролиза крахмала и в гидролизе сахарозы.

8. Делают вывод об избирательности и специфичности действия ферментов.