Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

Ярилин - Иммунология

.pdf
Скачиваний:
1839
Добавлен:
22.03.2015
Размер:
19.17 Mб
Скачать

4.8. Применение методов и принципов иммунологии...

703

Метод иммуноферментного анализа имеет серьезную теоретическую базу и достаточно совершенное инструментальное оснащение. В настоящее время используют практически исключительно твердофазный вариант метода (ELISA — Enzyme-linked immunosorbent assay). Его применяют в двух основных вариантах — конкурентном и двусайтовом. Конкурентный вариант обычно используют для определения антител к известным антигенам. В его основе лежит конкуренция за связывание с сорбированным антигеном меченых и немеченых (определяемых) антител: мерой концентрации оцениваемых антител служит степень подавления связывания меченых антител по сравнению с контролем, в котором конкурентные антитела заведомо отсутствуют. В качестве метки антител используют ферменты, чаще всего перокисдазу или щелочную фосфатазу, которые затем выявляют с помощью хромогенных субстратов. Двусайтовый вариант реакции обычно используют для определения антигена. Он основан на том, что антиген практически всегда несет более одного типа эпитопов. На пластиковую поверхность фиксируют антитела против одного эпитопа изучаемого антигена. Затем позволяют антигену связаться с этими антителами и наслаивают антитела, направленные против другого эпитопа («вторые антитела»). Связывание этих антител регистрируют с помощью антиизотипических антител, меченых пероксидазой или иными ферментами. В настоящее время с целью повышения чувствительности и стандартности все чаще вторые антитела метят стрептавидином, связывание которого затем выявляется с помощью биотина, конъюгированного с ферментом. Концентрация антигена (или второго антитела — в случае определения антител) пропорциональна связыванию ферментативной метки.

Метод проточной цитофлуорометрии зародился благодаря созданию прибора — лазерного проточного цитофлуориметра, позволяющего регистрировать с помощью лазерного луча параметры клеток, походящих через капилляр. Параметры регистрируются автоматически и подвергаются компьютерной обработке, результаты которой визуализируются в виде графиков. Метод позволяет исследовать параметры, основанные на светорассеянии — прямом (размер клетки) и боковом (зернистость). На основании этих параметров строится двумерное распределение клеток, в котором может быть задана область (соответстующая клеткам конкретных типов, локализация которых в этом «поле» известна). Дальнейший анализ строится на выявлении связанных с клетками флуоресцентных красителей. Красителями метят моноклональные антитела или иные реагенты, позволяющие определять маркерные молекулы на поверхности клетки (а при дополнительной обработке клеток — и внутри нее). В зависимости от числа лазеров, которым снабжен прибор, варьирует число дифференцируемых цветов (в современных приборах >10). Метод позволяет идентифицировать различные типы клеток, оценить плотность экспрессии маркера и другие многочисленные параметры. На этом же принципе основано фракционирование клеток, экспрессирующих определенные молекулы.

В последнее время для определения иммунологически значимых факторов, в том числе при иммунодиагностике, все чаще стали прибегать к использованию методов молекулярной биологии, в первую очередь полимеразной цепной реакции. Наиболее широкое применение получил метод

704

Глава 4. Иммунитет в защите и повреждении организма...

 

 

качественной ПЦР при типировнаии HLA, особенно II класса. Однако все большее распространение получает количественный вариант полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией, что позволяет оценить уровень экспрессии генов, в том числе кодирующих иммунологически значимые молекулы.

Методы, позволяющие оценивать функцию клеток, более разнообразны и значительно слабее стандартизированы. Пока они только частично могут быть вписаны в охарактеризованные выше лабораторные технологии.

Подходы к оценке состояния врожденного и адаптивного иммунитета заметно различаются.

4.8.1.3. Оценка состояния врожденного иммунитета

Для оценки состояния врожденного иммунитета применяют почти исключительно функциональные тесты, поскольку численность миелоидных клеток определяют с помощью элементарного анализа крови. Чаще других функций оценивают фагоцитарную активность клеток. Традиционно ее определяют микроскопически, в окрашенных мазках, с использованием в качестве фагоцитируемых частиц как микроорганизмов, так и инертных корпускул, например, частиц латекса. При этом вычисляют фагоцитарный индекс (процент клеток, осуществивших фагоцитоз тест-частиц) и фагоцитарное число (среднее число частиц, фагоцитированных клеткой). Такой подход в принципе адекватен, но он трудоемок, практически не поддается стандартизации и потому в значительной степени субъективен. Современные методы оценки фагоцитоза основаны на проточной цитометрии с применением объектов фагоциоза (бактерий, частиц), меченых флуорохромами.

С функциональной точки зрения более значима оценка бактерицидности фагоцитов, которую раньше определяли с помощью теста на завершенность фагоцитоза. Основой теста служило определение степени снижения числа микроорганизмов, высеваемых из лизата фагоцитов. Естественное стремление к упрощению и стандартизации позволило разработать несколько вариантов метода, основанных на проточной цитометрии. Помимо этого давно используют косвенную оценку бактерицидного потенциала фагоцитов в реакции восстановления нитросинего тетразолия. Активность фагоцитов определяют по появлению синего окрашивания в результате отложения гранул формазана — продукта восстановления нитросинего тетразолия. Дальнейшее усовершенствование метода состояло в разработке способа оценки способности клеток генерировать активные формы кислорода, которые выявляли по выраженности хемолюминесценции, усиливаемой в присутствии люминофоров (люминола, люцигенина). Как правило, параллельно оценивается спонтанная и индуцированная различными стимуляторами люминолзависимая хемолюминесценция. Хемилюминесценцию регистрируют автоматически на специальном приборе — хемилюминометре.

К группе тестов, характеризующих активность клеток врожденного иммунитета, относят определение их способности секретировать провоспалительные цитокины (IL-1β, TNFα и др.). Корректный вариант — постановка теста in vitro со стимуляцией лейкоцитов крови или выделенных макрофагов бактериальными стимуляторами (обычно ЛПС из Escherichia coli)

4.8. Применение методов и принципов иммунологии...

705

с последующим иммуноферментным определением цитокинов. Менее адекватно иммуноферментное определение цитокинов в сыворотке крови. При таком подходе невозможно разграничить процессы секреции и потребления цитокина, а также определить его происхождение.

Для характеристики состояния естественных киллеров параллельно используют функциональные тесты и определение численности клеток. Для идентификации NK-клеток обычно выявляют мембранные молекулы CD56 и CD16 методом проточной цитомтерии с использованием соответствующих антител. Одновременно оценивают соотношение двух основных субпопуляций NK-клеток CD56lo CD16+ и CD56hi CD16-. Опыт показывает, что для характеристики популяции естественных киллеров недостаточно подсчета этих клеток, а также их разновидностей: требуется параллельно оценивать их функциональную активность (поскольку нередки случаи обратной корреляции численности и активности NK-клеток). Традиционный метод оценки функциональной активности естественных киллеров — радиометрическое определение выхода в среду 51Cr, предварительно введенного в

клетки. Это достаточно точный и информативный метод, однако он неудобен в связи с необходимостью использования радионуклида, являющегося γ-излучателем, и поэтому сейчас его используют редко. Он заменен другим вариантом радиометрического метода, основанного на оценке ослабления включения 3Н-уридина, предварительно введенного в клетки-мише- ни и выходящего из них при цитолизе. Будучи β-излучателем, 3Н-уридин представляет меньшую опасность. Предложено несколько вариантов оценки гибели меченых флуорохромами клеток-мишеней, с помощью проточной цитометрии, которые пока не вытеснили радиометрические методы. Наиболее интересный и перспективный подход к цитофлуорометрической оценке цитотоксических клеток — метод, основанный на выявлении мембранной экспрессии молекулы CD107 (LAMP-1). Эта молекула в норме отсутствует на клеточной поверхности, но содержится на мембранах лизосом, включая цитотоксические гранулы цитотоксических лимфоцитов. При секреции цитотоксических гранул их мембрана сливается с клеточной мембраной, и молекула CD107 оказывается на поверхности клетки.

Еще одна группа показателей, характеризующих функциональный потенциал системы врожденного иммунитета, позволяет оценить состояние системы комплемента. Реакции, основанные на титровании комплемента с определением 50% гемолиза, не используют в связи с их громоздкостью. С помощью иммуноферментного анализа оценивают концентрацию в сыворотке крови основных компонентов комплемента, в первую очередь C3.

Фактически приведенными методами ограничивается спектр подходов

клабораторной характеристике системы врожденного иммунитета. Такая важнейшая функция, как антигенпрезентирующая, не входит в число определяемых показателей. Отсутствуют общепринятые лабораторные подходы

кхарактеристике популяции дендритных клеток.

4.8.1.4. Оценка состояния адаптивного иммунитета

В основе комплекса методов, предназначенных для оценки состояния адаптивного иммунитета, лежит определение реализующих его клеток. Для этого используют методы проточной цитометрии. Общепринято

706

Глава 4. Иммунитет в защите и повреждении организма...

 

 

использование с этой целью антител к маркерным антигенам, меченых флуорохромами. Суммарную популяцию Т-лимфоцитов тестируют с помощью моноклональных антител к СD3, а 2 их основные субпопуляции — с помощью антител к CD4 и CD8. Поскольку молекула CD3 — абсолютный маркер Т-лимфоцитов, то при определении CD4+ и CD8+ Т-клеток их параллельно окрашивают моноклональными антителами к CD3, так как молекулы CD4 и CD8 могут экспрессироваться не только Т-лимфоцитами. При этом применяют окрашивание антителами, мечеными контрастными флуорохромами (например, зеленым, оранжевым или розовым). Для выявления В-лимфоцитов довольствуются использованием антител к CD19 — молекуле, присутствующей на всех В-клетках и только на них. Антитела к тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов используют редко, поскольку ни одна из разновидностей цепей не присутствует на всех В-клетках. Определение мембранных κ- и λ-цепей используют для оценки моноклональности В-лимфоцитов при лимфопролиферативных процессах.

В лабораторной практике функцию лимфоцитов оценивают редко, хотя, строго говоря, функциональные показатели важнее, чем показатели численности клеток. Игнорирование функциональной активности лифмоцитов связано с техническими проблемами, возникающими при постановке функциональных тестов, с их громоздкостью, трудоемкостью и дороговизной. Адекватный подход к суммарной оценке функционального потенциала (а не конкретной функции) — методы измерения пролиферативного ответа лимфоцитов (в основном Т-клеток) на митогенную стимуляцию. В качестве митогенов раньше использовали растительные митогенные лектины — фитогемагглютинин, реже конканавалин А, в настоящее время — активирующие моноклональные антитела к CD3 (оптимально — анти- CD3-антитела, фиксированные на пластике, в сочетании с растворимыми антителами к костимулирующей молекуле CD28). Все перечисленные митогены вызывают поликлональный митогенный ответ, который поддается достаточно точному измерению в отличие от олигоклонального ответа на конкретные антигены, интенсивность которого обычно ниже чувствительности используемых методов.

Пролиферацию чаще всего количественно оценивают по включению 3Н-тимидина. Несмотря на неудобства, обусловленные использованием радионуклида, этот метод остается эталонным благодаря высокой чувствительности, способности выявлять достаточно тонкие изменения измеряемого показателя. Существует несколько альтернативных подходов, основанных на использовании проточной цитометрии, наиболее интересен из которых тест на разбавление флуоресецентной метки CFSE (Carboxyfluorescein succinyl ester). Этот флуорохром связывается с внутриклеточными белками клетки, не нарушая ее жизнеспособности и функциональной активности, и при делении в равных количествах переходит в дочерние клетки. При проточной цитометрии выявляют распределение меченых клеток в виде нескольких пиков, из которых правый (с максимальным содержанием красителя) соответствует неделившимся клеткам, а следующие за ним справа налево пики отражают численность клеток, делившихся 1, 2, 3 раза и т.д. Помимо возможности измерения числа клеток, прошедших определенное число делений, при условии выявления различных маркеров можно допол-

4.8. Применение методов и принципов иммунологии...

707

нительно охарактеризовать свойства клеток в каждом пике. Более простой цитофлуорометрический подход дает возможность суммарно определить долю клеток, находящихся в цикле, измеряя процент клеток с гипердиплоидным содержанием ДНК; для этого клетки окрашивают флуоресцентным красителем, связывающимся с ДНК — пропидия йодидом. Использование специально разработанных программ позволяет определить число клеток, находящихся в фазах цикла G1+S, G2, а также в митозе.

Иногда возникает необходимость оценить процент клеток, вступающих

вапоптоз (что с определенной натяжкой также можно рассматривать как функциональную характеристику клеток). С этой целью используют вышеописанный цитофлуорометрический подход с окрашиванием клеток пропидия йодидом. Однако при этом определяют число клеток в гиподиплоидном пике, расположенном левее диплоидного (при апоптозе теряется часть ядерного материала, содержащего ДНК). Другой метод цитофлуорометрической оценки апоптоза состоит в определении связывания аннексина V, меченого флуорохромом. Этот реагент специфически взаимодействует с фосфатидилсерином, который появляется на поверхности клетки только при апоптозе.

Кфункциональным тестам, позволяющим в определенной степени охарактеризовать реактивность клеточных клонов, относят тест торможения миграции лейкоцитов. Он основан на быстрой (после 20–30-минутной инкубации) регистрации in vitro ослабления миграции из капилляров лейкоцитов крови человека под влиянием комплекса цитокинов, секретируемых лимфоцитами или иными клетками. К достоинствам этого метода относят его чувствительность, быстроту выполнения и возможность стандартизации.

Оценка функциональной активности субпопуляций Т-лимфоцитов обычно не входит в программу лабораторного обследования больных. В особых случаях, когда подобная задача возникает, функцию Т-хелперов определяют по способности продуцировать цитокины. Для дифференцирования Th1- и Th2-клеток исследуемую популяцию лимфоцитов стимулируют сочетанным действием форболмиристат ацетата (неспецифический активатор протеинкиназы С) и иономицина (кальциевый ионофор), что обеспечивает ускоренную активацию клеток в обход антигенраспознающих рецепторов. Клетки обрабатывают брефелдином А, блокирующим внутриклеточный транспорт молекул с участием аппарата Гольджи (включая процесс секреции) с целью сохранения внутри клетки синтезируемых молекул. Затем нарушают целостность клеточной мембраны путем обработки сапонином и инкубируют клетки с моноклональными антителами к цитокинам, меченым флуорохромом, после чего проводят проточную цитометрию. Обычно

вклетках выявляют синтез ключевых цитокинов Th1- и Th2-клеток — соответственно IFNγ и IL-4.

Чаще, особенно зарубежные специалисты, оценивают секрецию Th1-клетками IFNγ с использованием метода ELISPOT (Enzyme-linked

immunospot). В этом случае клетки инкубируют на нитроцеллюлозной мембране, сенсибилизированной антителами к IFNγ (или другому определяемому цитокину — в зависимости от задач исследования) в присутствии стимулятора и затем с помощью иммуноферментного метода определяют фиксацию секретированного цитокина на нитроцеллюлозной мемб-

708

Глава 4. Иммунитет в защите и повреждении организма...

 

 

ране (секертируемый IFNγ связывается с фиксированными антителами и может быть обнаружен с помощью вторых антител, меченых пероксидазой). Число окрашенных пятен, соответствующих клеткам, секретирующим цитокин, подсчитывают с помощью специального прибора или под микроскопом. Этот метод широко используют также для отбора Т-клеточных эпитопов при создании вакцин.

Функцию цитотоксических Т-лимфоцитов определяют с помощью тех же подходов, которые используют для фукнциональной оценки NK-клеток. Однако получение данных сильно осложняется, во-первых, необходимостью предварительной индукции активности этих клеток в смешанной культуре лейкоцитов, а во-вторых, очень малой частотой антигенспецифических Т-клеток в популяции. В рутинной лабораторной практике определение этих клеток не проводят.

В арсенале методов лабораторной оценки адаптивного звена иммунной системы отсутствуют тесты на состояние специфического гуморального иммунитета, хотя теоретически антителообразующую способность клеток В-ряда можно оценивать с использованием ELISPOT. Однако для индукции антителообразования in vitro необходимы усилия, трудновыполнимые даже при научных исследованиях. Именно поэтому подходы к оценке состояния гуморального иммунитета ограничиваются определением концентрации иммуноглобулинов основных классов, для чего используют иммуноферментный метод. Менее предпочтителен используемый до сих пор метод радиальной иммунодиффузии, основанный на оценке диаметра кольца преципитации, формирующегося при диффузии исследуемых белков в агар, содержащий антитела к определяемому иммуноглобулину. Реже определяют естественные антитела к распространенным бактериальным антигенам и маркерам групп крови. Для выявления пролиферативного потенциала В-лимфоцитов оценивают их пролиферативный ответ на действие митогена лаконоса — растительного лектина, вызывающего Т-зависимую поликлональную пролиферацию В-клеток.

Тесты in vivo практически не используют при лабораторной иммунодиагностике в связи с их инвазивностью. Следует назвать лишь пробы с внутрикожным введением комплекса распространенных антигенов (кандидозный антиген, стрептокиназа-стрептодорназа, туберкулин и другие антигены; в качестве варианта вводят митогены или гаптены, например, динитрохлорбензол). Результаты тестирования оценивают по интенсивности воспалительной реакции, развивающиеся в местах введения. Такие тесты информативны, поскольку адекватно отражают функциональное состояние популяции Т-лимфоцитов (например, при первичных иммунодефицитах) и коррелируют с исходом некоторых патологических процессов, в том числе опухолевых. Тем не менее в связи с инвазивным характером воздействия эти подходы используют достаточно редко.

Резюмируя краткий обзор арсенала методов иммунодиагностики, подчеркнем его ограниченность и несопоставимость по степени информативности и однозначности при трактовке результатов с методами диагностики, сложившимися в других областях медицины. Ситуацию усугубляет часто неадекватная трактовка результатов иммунологического обследования, обусловленная ограниченностью иммунологических знаний во врачебной среде.

4.8. Применение методов и принципов иммунологии...

709

4.8.2. Иммунопрофилактика

Иммунологические принципы реализуются в профилактике инфекционных заболеваний и иммунозависимой патологии в форме вакцинации. Наиболее длительную и богатую историю имеет вакцинация с целью предупреждения инфекционных заболеваний. С разработки первых подходов к предупреждению инфекционных заболеваний более тысячелетия тому назад началась предыстория иммунологии, а в конце XIX века успешное создание методов вакцинации породило иммунологию как самостоятельную научную дисциплину.

4.8.2.1. Вакцинация против возбудителей инфекционных заболеваний

В главе 1 кратко рассмотрена предыстория иммунологии, однозначно сводимая к истории вакцинации. Около 3 тыс. лет назад впервые письменно упомянуто предупреждение заболевания оспой путем ее прививки, многие столетия использовавшееся (в основном в Азии) в форме вариоляции. В конце ХVIII в. Э. Дженнер разработал безопасный и надежный метод профилактики оспы путем вакцинации — прививки материала, содержащего инфекционный агент коровьей оспы. В 1880 г. Л. Пастер разработал (на примере холеры кур) общие принципы вакцинации с использованием живой ослабленной вакцины. В результате целенаправленного «ослабления» вируса бешенства была получена вакцина, защищающая людей от поражения этим вирусом при заражении в результате укусов животных. После этого деятельность по созданию и использованию вакцин стала непрерывной и кодифицировалась законами.

Первоначальный смысл понятия «вакцина» заключен в следующем определении. Вакцинами называют препараты, предназначенные для формирова-

ния иммунологической памяти и протективного иммунитета к антигенам возбудителей, минуя стадию инфекционного заболевания. Вакцинацией называют способ создания протективного иммунитета с помощью вакцин. Расширенное употребление термина «вакцины» (в отношении препаратов с противоопухолевой, противоаллергичекой активностью или направленных на лечение аутоиммунных заболеваний) заставляет несколько изменить акценты. В этом, новом смысле под вакцинами следует понимать препараты, содер-

жащие антигенный материал, направленные на предотвращение и лечение инфекционных, опухолевых процессов, а также проявлений гиперчувствительности путем индукции эффекторных клеток и клеток памяти, оказывающих защитное действие. В этом разделе речь пойдет о противоинфекционных вакцинах.

Различают несколько развновидностей вакцин, характеристики которых представлены в табл. 4.22. Исходный вариант вакцин, введенный в

практику Л. Пастером, представляет живые аттенуированные (ослабленные) вакцины. Пастер использовал для этого культивирование в неблагоприятных условиях. Очевидно, причиной ослабления вирулентности послужили серии мутаций, обеспечивавших приспособление микроорганизма к измененной среде обитания с утратой качеств, которые в этих условиях не давали преимуществ (патогенности, вирулентности). Такие вакцины, как правило, эффективны, но всегда существует опасность реверсии с восстановлением патогенности и вирулентности. Кроме того,

710

Глава 4. Иммунитет в защите и повреждении организма...

 

 

при ослабенном иммунитете (например, при первичных иммунодефицитах у детей) даже аттенуированные патогены могут вызвать инфекционный процесс. Вариант такого подхода — противооспенная вакцина Э. Дженнера, полученная на основе вируса коровьей оспы, который у человека вызывает слабовыраженное заболевание, но, в силу перекрестной антигенной реактивности, обеспечивает иммунитет против вируса человеческой оспы.

Таблица 4.22. Разновидности вакцин

Тип вакцины

Характеристика

Примеры

 

 

 

Живые ослабленные

Вирулентность патогенов

Вакцины против оспы,

(аттенуированные)

снижена разными спосо-

краснухи, кори, полиоми-

 

бами, в частности культи-

елита (вакцина Сэбина),

 

вированием в неблагопри-

герпеса, БЦЖ

 

ятных условиях. Вакцины

 

 

эффективны, но сохраня-

 

 

ют опасность реверсии

 

 

 

 

Убитые

Патогены убиты различ-

Вакцины против бешенст-

 

ными способами (форма-

ва, тифа, холеры, поли-

 

лином и др.). Вакцины

омиелита (вакцина

 

менее эффективны, чем

Солка), коклюша

 

живые

 

 

 

 

Антитоксические

Анатоксин, или токсоид

Вакцины против дифте-

 

(инактивированный ток-

рии, столбняка

 

син) в сочетании с адъю-

 

 

вантом

 

 

 

 

Синтетические

Синтетический эпитоп,

Вакцины против саль-

 

конъюгированный с

монеллеза, йерсиниоза,

 

иммуногенным носителем

ящура, гриппа

 

или адъювантом

 

 

 

 

Рекомбинантные

Основаны на исполь-

Вакцины против гриппа,

 

зовании методов моле-

герпеса, везикулярного

 

кулярной генетики.

стоматита и т.д

 

Выделенный ген протек-

 

 

тивного антигена вводят в

 

 

безопасный вектор. Гены

 

 

вирулентности удаляют с

 

 

сохранением протектив-

 

 

ных генов и т.д.

 

 

 

 

ДНК-вакцина

Плазмиду, содержащую

Вакцины против

 

ген протективного анти-

гепатита В

 

гена, вводят в мышцу, в

 

 

клетках которой он экс-

 

 

прессируется

 

 

 

 

Идиотипические

Вместо антигена исполь-

Экспериментальные

 

зуют антиидиотипические

вакцины

 

антитела, воспроизво-

 

 

дящие конфигурацию

 

 

эпитопа

 

 

 

 

4.8. Применение методов и принципов иммунологии...

711

Другой распространенный вид традиционных вакцин — убитые вакцины — предложен Р. Пфеффером (R. Pfeiffer) и У. Колле (W. Kolle) также в конце XIX века. Убитые вакцины в принципе не могут вызвать инфекционных осложнений, но они могут быть токсичны, аллергенны и иметь другие побочные эффекты, обычно обусловленные примесями. Метод, применяемый для того, чтобы убить патогены, не должен вызывать инактивацию протективных антигенов. Такие вакцины используют для профилактики сальмонеллеза, брюшного тифа и ряда других заболеваний, особенно вызываемых внеклеточными патогенами. Убитые вакцины более безвредны, но, как правило, менее эффективны, чем ослабленные, что связано с отсутствием самоподдержания микробных клеток.

Логическое развитие принципа использования убитых микроорганизмов — их фракционирование и включение в вакцинный препарат субклеточных компонентов, содержащих протективные антигены (субъединичные вакцины). Следующим шагом на этом пути стало создание химических вакцин путем выделения активных молекул или их химического синтеза.

Вариант вакцин — препараты на основе продуктов микроорганизмов — токсинов, предназначенные для их инактивации. В интактном виде использовать токсины невозможно в связи с их токсичностью. Для вакцинации применяют анатоксины — токсины, инактивированные обработкой формалином или иными агентами, устраняющими токсичность с сохранением антигенности. Широко распространена вакцинация дифтерийным, столбнячным и другими анатоксинами. Нередко вакцинные препараты содержат комбинацию из вакцин против различных возбудителей и их анатоксинов; при таком комбинировании может происходить взаимное усиление (адъювантность) отдельных компонентов вакцин. Классический пример такой комбинации — вакцина АКДС, содержащая дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин и убитые Bordetella pertussis.

В последние десятилетия наметились коренные изменения в подходах к способам создания вакцин. Наиболее перспективным выглядит направление, основанное на использовании генно-инженерных подходов. Это позволяет, предварительно «разобрав» гены возбудителя, исключить из генома гены вирулентности и сохранить гены, кодирующие протективные антигены (рис. 4.52). В качестве вектора, в который вводят переконструированные гены, часто используют вирус осповакцины, сам по себе способствующий формированию гуморального и клеточного иммунного ответа.

Другой способ создания вакцин нового типа состоит в конструировании комплекса полностью синтетических субъединиц, одни из которых несут В-клеточные эпитопы, другие служат источником Т-клеточных эпитопов, а третьи отвечают за активацию клеток врожденного иммунитета. При этом структуру В-эпитопов могут воспроизводить синтетические пептиды или полисахариды, сами по себе не иммуногенные, но приобретающие эти свойства в комбинации с другими компонентами системы. При всей рациональной безукоризненности таких подходов для них характерна более слабая иммуногенность, чем для традиционных вакцин. Очевидно, это результат неполноты знаний о природе антигенности и иммуногенности, в связи с чем конструируемые таким образом вакцинные препараты

712

Глава 4. Иммунитет в защите и повреждении организма...

 

 

Пример I

Создание вектора для вакцинации на основе вируса коровьей оспы

Вирусный

 

 

 

ДНК,

 

Точка действия

кодирующая

промотор.

 

 

рестрикционного

протективный

Ген вируса

энзима

 

антиген

 

 

 

 

 

Ген вируса

возбудителя

 

Плазмида

 

 

 

 

Внедренный ген

 

 

 

протективного

 

 

 

антигена

 

 

Рекомбинант:

 

 

ная плазмида

Вирус коровьей

 

 

 

 

 

 

 

оспы

 

 

Рекомбинантный

 

 

вирус

 

Пример II

Аттенуация вируса с помощью молекулярно:биологического подхода

Патогенный

вирус

 

Гены вируса.

Другие гены

Ген вирулент:

ности

Вирус после

удаления гена вирулентности

Рис. 4.52. Использование молекулярно-биологических подходов для создания вакцинных препаратов. Приведены примеры использования молекулярной инженерии для конструирования вакцин. Пример I иллюстрирует создание рекомбинантной вакцины. Сначала формируют плазмиду — путем внедрения гена, кодирующего антиген, под промотор другого гена, что дает преимущества при дальнейших манипуляциях. Полученную плазмиду внедряют в «нейтральный» вирус, в качестве которого обычно используют вирус коровьей оспы, используемый как носитель. Получаемый рекомбинантный вирус применяют как основу рекомбинантной вакцины. Пример II иллюстрирует принцип модификации генов возбудителя (обычно вируса) с целью лишения его вирулентности. Для этого гены вируса «разбирают», удаляют гены вирулентности и снова «собирают». В результате устраняются отрицательные эффекты вируса с сохранением его антигенов, обеспечивающих протективный эффект вакцины

не содержат некоторых, пока неизвестных компонентов, обязательных для обеспечения иммуногенности в полной мере. По мере пополнения знаний в этой области будут совершенствоваться вакцины такого рода. Так, недавно установленный факт зависимости адаптивного иммунного ответа от стимуляции врожденного иммунитета «образами патогенности» (РАМР) уже сейчас учитывается при построении новых вакцинных препаратов.

Адъюванты

Проблему усиления иммуногенности вакцин, а также препаратов, используемых в экспериментальной практике, обычно решают с помощью использования адъювантов — веществ, усиливающих иммунный ответ при введении одновременно с иммуногенами. Данные по адъювантам представлены в табл. 4.23. Различают несколько групп адъювантов — минеральные (алюминиевые квасцы — Al(OH)2 и др.), растительные (сапонины), микроб-