Мистерии сибирской язвы (учебник)

Раздел I • 4. Штаммы из Кот-д’Ивуара и Камеруна

нии(1). Конечно, тут можно возразить, что штамм у человека вызывает пневмонию и, вероятно, эволюционно сформировал механизмы именно для лёгочной инвазии, однако опыты<2> показывают, что он также почти авирулентен и при заражении интраназально (через аэрозольные капли), поскольку, чтобы вызвать летальный исход инфекции у кролика, необходима доза в 100 раз больше, чем для штаммов B. anthracis!

Ещё одной интересной особенностью штамма является наличие на хромосоме как характерной для B. cereus области plcR, кодирующей синтез токсинов (в частности, гемолизинов A, BL, II и III), так и характерного для B. anthracis гена atxA, хотя и непонятно, как они «уживаются» вместе. Внимательные уже думают, что тут ошибка, ведь у сибиреязвенного микроба atxA расположен на плазмиде рХО1. Но дело в том, что плазмида рВСХО1 несёт лишь похожий ген atxA1, поэтому она не играет роли в уникальном «сосуществовании» данных генов на хромосоме, которое приводит к тому, что при 25 °С штамм проявляет гемолитическую и цитолитическую активность, чего не наблюдается при 37 °С. Однако именно при последней температуре плазмида рВСХО1 замедляет работу хромосомных генов, участвующих в метаболизме, но ускоряет гены, кодирующие синтез мембранных белков. Кроме того, ускоряется и процесс споруляции, однако пока непонятно, какими генетическими элементами это управляется. Таким образом, штамм ведёт как бы двойную жизнь, переключаясь при увеличении температуры от фенотипа B. cereus к фенотипу B. anthracis, поэтому его именуют

кроссоверным (cross-over).

Подобных штаммов обнаружено немного, поскольку лишь некоторые штаммы, выделенные от сварщиков, являются кроссоверными. Так, штаммы ST108, G9898 и ST78, также выделенные от сварщиков с сибиреязвенной пневмонией соответственно в 2020

1 Примечательно, что штаммы Bcbva, напротив, способны вызвать у них заболевание при интраназальном введении, а летальные дозы аналогичны сибиреязвенным

(см. Ferris A. M., Dawson D. G., et al. Bacillus cereus biovar anthracis causes inhalational anthrax-like disease in rabbits that is treatable with medical countermeasures. PLoS Negl Trop Dis. 2025; 19(4):e0012973; DOI:

10.1371/journal.pntd.0012973).

2 Wilson M. K., Vergis J. M., et al. Bacillus cereus G9241 makes anthrax toxin and capsule like highly virulent B. anthracis Ames but behaves like attenuated toxigenic nonencapsulated B. anthracis Sterne in rabbits and mice. Infect Immun. 2011;79(8):3012–3019; DOI: 10.1128/IAI.00205–11.

70

Мистерии сибирской язвы

году в штате Техас (США), в 1996 и 2020 годах в штате Луизиана (США), хотя и имеют гены сибиреязвенного токсина cya, lef и pagA, вовсе не несут ген atxA. При этом хромосома первого штамма наиболее близка B. anthracis, а второго и третьего – B. tropicus.

Говоря о B. tropicus, нельзя не упомянуть штаммы JMT, впервые<1> выделенные в середине прошлого века от людей с прибрежной лихорадкой и от мелких млекопитающих, для которых заражение ими смертельно. Начиная с 2011 года на некоторых фермах в провинции Гуандун (Китай) и на острове Тайвань регистрируется смерть китайских триониксов (Pelodiscus sinensis), вызванная указанными штаммами, которых изначально по результатам ПЦР диагностики отнесли к видам B. cereus и B. thuringiensis. Однако симптомы заболевания у этих черепах свидетельствовали не о кишечной инфекции, обычно вызываемой штаммами B. cereus, а о системной (при этом микроскопия спор не обнаруживает характерных для B. thuringiensis параспоральных тел). Дальнейшие исследования< 2 > отнесли эти штаммы к виду B. tropicus, однако показали, что на единственной плазмиде присутствуют гены сибиреязвенного токсина cya и pagA (отёчный фактор и протективный антиген), а также гены, кодирующие синтез гиалуроновой кислоты и экзополисахарида (как у штамма B. cereus G9241).

Таким образом, в штаммах близкородственных видов могут встречаться не только почти идентичные сибиреязвенные плазмиды, но и их отдельные гены. Интересно, что в штаммах B. cereus D- 17, B. cereus ATCC 43881 и B. thuringiensis ATCC 33679 обнаруживает-

ся более половины ORF плазмиды рХО1, а в штамме B. cereus ATCC 10987 – лишь 40 % нуклеотидной идентичности, в которой уже отсутствуют гены острова патогенности. В штамме B. thuringiensis AWO06 обнаруживаются гены плазмиды рХО2, а штаммы CBD 118 и CBD 119, относящиеся к неродственному сибиреязвенному микробу виду B. circulans и неопознанному виду, на 97 % идентичному

B.luciferensis соответственно, несут лишь 10 генов плазмиды рХО2.

1Heaslip W. Bacillus tropicus, a new species isolated from man and animals described and compared with other Bacilli resembling, Bacillus anthracis. Med J Australia. 1941; 2(19):536–543; DOI: 10.5694/j.1326– 5377.1941.tb54246.xopen_in_new.

2Tsai J.-M., Kuo H.-W., et al. Retrospective Screening of Anthrax-like Disease Induced by Bacillus tropicus str. JMT from Chinese Soft-Shell Turtles in Taiwan. Pathogens. 2023; 12(5):693; DOI: 10.3390/pathogens12050693.

71

Раздел I • 4. Штаммы из Кот-д’Ивуара и Камеруна

Однако и с самими плазмидами B. anthracis не всё так просто. Остров патогенности плазмиды pXO1, например, включает два кластера генов, заслуживающих особого внимания. Первый – это кластер генов прорастания gerXA (ORF 113), gerXB (ORF 114) и gerXC (ORF 112), кодирующих белки, сходные с таковыми у B. subtilis(1), B. cereus и B. megaterium. Важно подчеркнуть, что в случае последних речь идёт о хромосомных генах! Примечательно, что указанные белки обеспечивают прорастание споры в альвеолярных макрофагах, то есть они строго специфичны (за дальнейшее выживание отвечают отёчный и летальный факторы).

Гены второго кластера (ORF 93, ORF 94 и ORF 95) похожи на гены hasA, hasB и hasC, участвующие в синтезе серотип-специфической полисахаридной капсулы вирулентных стрептококков группы А. Конечно, у сибиреязвенного микроба полисахаридная капсула не обнаружена и эти гены принято считать нефункциональными. Подтверждают эту мысль как и описанные ранее штаммы CI и СА, так и исследование<2> уже упомянутого штамма B. cereus G9241, которое показало, что ген hasACB плазмиды рВСХО1 кодирует синтез капсулы из гиалуроновой кислоты (т. е. дисахаридного полимера), а ген bpsX-H плазмиды рВС210 – синтез экзополисахарида (от англ. Bacillus cereus exo-polysaccharide), что в совокупности обеспечивает устойчивость бактерий к фагоцитозу и обуславливает их способность вызывать заболевание, похожее на ингаляционную форму сибирской язвы. При этом напомним, что ген hasA имеется у B. anthracis, но содержит делецию, ввиду чего синтез гиалуроновой кислоты прекращается до капсулообразования.

Интересной особенностью плазмиды рХО1 является также сравнительно небольшой средний размер её ОRF – всего 610 п. н., что поразительно схоже с размерами ORF (507 п. н.) у плазмид Borrelia burgdorferi, возбудителя болезни Лайма, чья значительная часть ге-

1Вместе с тем gerA, gerB, gerK и yfk у B. subtilis являются оперонами, кодирующими по три гена (то есть gerA включает gerA, gerAВ и gerAС), тогда как все три ger-гена

B.anthracis принадлежат только к одному оперону.

2Oh S.-Y., Budzik J. M., et al. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthraxlike disease. Mol Microbiol. 2011; 80(2):455–470; DOI: 10.1111/j.1365–2958.2011.07582.x.

72

Мистерии сибирской язвы

нов повреждена (стала псевдогенами). И хотя<1> достоверно неизвестно, протекает ли эволюция B. anthracis тем же путём, высказывается предположение, что как минимум часть нефункционирующих генов находится на грани вымирания, однако этот процесс «застрял» в медленной эволюции возбудителя (медленность эволюции обусловлена долгим пребыванием в состоянии споры).

Всё вышесказанное указывает на высокое сходство геномов сибиреязвенного микроба и его ближайших родственников, а дальнейшие генетические исследования( 2 ),< 3 > привели к пониманию

B. anthracis, B. cereus и B. thuringiensis как членов группы одного вида

– B. cereus, который именуется Bacillus cereus complex или Bacillus cereus sensu lato (B. cereus sl), то есть «в широком смысле».

Следует оговориться, что выделение группы B. cereus complex не было утверждено Международным комитетом по систематике прокариот, однако принято научным сообществом. Группа включает не менее восьми видов, поскольку из-за крайней запутанности внутригрупповой таксономии только по восьми видам существует некий консенсус, тогда как вопрос включения других 4 является предметом споров(5). К этим видам относят B. anthracis, B. cereus sen-

1Okinaka R. T., Cloud K., et al. Sequence and organization of pXO1, the large Bacillus anthracis plasmid harboring the anthrax toxin genes. J Bacteriol. 1999; 181(20):6509–6515; DOI: 10.1128/jb.181.20.6509– 6515.1999.

2Дело в том, что до эры молекулярно-генетических исследований классификация строилась в основном на схожести образа жизни (патогенности) и морфологии колоний. Так, например, B. anthracis и B. cereus считались различными видами, в том числе из-за высокой патогенности первого и способности формировать характерные «восковые» колонии второго, из-за чего он и получил своё название (от лат. cera –

«воск»).

3Helgason E., Okstad O. A., et al. Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis – one species on the basis of genetic evidence. Appl Environ Microbiol. 2000; 66(6):2627–2630; DOI: 10.1128/AEM.66.6.2627–2630.2000.

4Среди них ранее упомянутый Bacillus tropicus, а также Bacillus paranthracis, Bacillus pacificus, Bacillus albus, Bacillus mobilis, Bacillus luti, Bacillus proteolyticus, Bacillus nitratireducens и Bacillus paramycoides (см. Liy Y., Du J., et al. Proposal of nine novel species of the Bacillus cereus group. Int J Syst Evol Microbiol. 2017; 67(8):2499–2508; DOI: 10.1099/ijsem.0.001821).

5Высказываются предложения как считать всю группу одним полиморфным видом, состоящим из групп штаммов, отличающихся между собой наличием определённых детерминант патогенности и регуляторных генов, так и выделить в рамках группы 20 и более видов.

73

Раздел I • 4. Штаммы из Кот-д’Ивуара и Камеруна

su stricto (B. cereus ss), то есть «в узком смысле», B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides, B. cytotoxicus и B. toyonensis(1).

Выделение новых видов, как правило, основывается на in silico

(компьютерных) расчётах средней идентичности нуклеотидов – ANI

(от англ. average nucleotide identity). Суть этого метода, предложенного<2> в 2005 году, заключается в фрагментации последовательности генома, полученной по данным полногеномного секвенирования, на фрагменты определённой длины, последующем сравнении полученных фрагментов с эталонным геномом и вычислении среднего процента совпадений идентичных пар. Тогда если два генома имеют значение ANI выше установленного «порога», то они считаются членами одного геномовида. Однако остаётся открытым вопрос, какое значение считать пороговым.

На практике значения ANI обычно находятся выше 80, потому что для разделения видов порога в 80 ANI (т. е. до 80%-ного совпадения) вполне достаточно, чего нельзя сказать о представителях B. cereus complex. Так, если мы в качестве порога возьмём 92,5 ANI<3>, то вид B. anthracis станет подвидом нового полиморфного вида B. mosaicus (получил своё название, поскольку объединил несколько видов), а если поднимем порог до 95 ANI< 4 >, то часть штаммов B. cereus, вызывающих сибиреязвенноподобные состояния, «отойдёт» B. tropicus. Происходит это из-за того, что штаммы, обозначенные как «типовые», не всегда генетически «центральны». Кроме того, определённую путаницу вносит и учёт фенотипа, который

1 B. subtilis не вошёл в группу, поскольку имеет отличную организацию генома

(см. Økstad O. A., Hegna I., et al. Genome organization is not conserved between Bacillus cereus and Bacillus subtilis. Microbiology (Reading). 1999; 145 (Pt 3):621–631; DOI: 10.1099/13500872–145–3–621; Wunschel D., Fox K. F., et al. Discrimination among the B. Cereus group, in comparison to B. subtilis, by structural carbohydrate profiles and ribosomal RNA spacer region PCR. Systematic and Applied Microbiology. 1995;

17(4):625–635; DOI: 10.1016/S0723–2020(11)80085–8). Вместе с тем именно штаммы B. subtilis повсеместно используются для работ по клонированию генов, созданию вакцин и т. д.

2Konstantinidis K. T., Tiedje J.M. Genomic insights that advance the species definition for prokaryotes. PNAS. 2005; 102(7):2567–2572; DOI: 10.1073/pnas.0409727102.

3Carroll L. M., Wiedmann M., et al. Proposal of a taxonomic nomenclature for the Bacillus cereus group which reconciles genomic definitions of Bacterial species with clinical and industrial phenotypes. mBio. 2020; 11(1):e00034–20; DOI: 10.1128/mBio.00034–20.

4Carroll L. M., Cheng M., et al. Keeping up with the Bacillus cereus group: taxonomy through the genomics era and beyond. Crit Rev Food Sci Nutr. 2022; 62(28):7677–7702; DOI: 10.1080/10408398.2021.1916735.

74

Мистерии сибирской язвы

может совпадать у штаммов нескольких геномовидов и отличаться среди штаммов одного геномовида.

Вместе с тем сторонников подхода, предлагающего считать штамм принадлежащим геномовиду, если его геном имеет ≥ 92,5 ANI с геномом типового штамма1 этого геномовида, становится в научном сообществе всё больше. В рамках него внутривидовая таксономия принимает следующий вид<2>:

1То есть штамма, геном которого признан эталонным для данного геномовида и

всравнении с которым определяют, относится изучаемый геном к данному геномовиду или нет.

2Carroll L. M., Wiedmann M., et al. Proposal of a taxonomic nomenclature for the Bacillus cereus group which reconciles genomic definitions of Bacterial species with clinical and industrial phenotypes. mBio. 2020; 11(1):e00034–20; DOI: 10.1128/mBio.00034–20; Carroll L. M., Cheng M., et al. Keeping up with the Bacillus cereus group: taxonomy through the genomics era and beyond. Crit Rev Food Sci Nutr. 2022; 62(28):7677–7702; DOI: 10.1080/10408398.2021.1916735.

75

Мистерии сибирской язвы

«сгладить углы» путём выделения подвидов и биоваров. Так, штамм B. anthracis, разделяющий с типовым штаммом Ames минимум 99,9 ANI и(или) имеющий фенотипические характеристики, отличающие его от B. cereus ss (например, отсутствие подвижности), они предлагают относить к B. mosaicus subsp. anthracis, а если штамм синтезирует сибиреязвенные токсины и(или) имеет гены, их кодирующие (cya, lef и pagA), – к B. mosaicus subsp. anthracis bv. Anthracis. При этом подвид возможно записывать кратко как B. anthracis, а биовар – как B. anthracis, чтобы не вступать в противоречие с историческим названием (но попробуйте не запутаться с курсивом).

Важно ещё отметить, что капсульные гены намеренно исключены, чтобы избежать ситуации, когда вызывающий сибирскую язву штамм имеет иную капсулу (например, экзаполисахаридную). То есть сюда предлагается относить ранее упомянутые кроссоверные штаммы B. cereus G9241, ST108, G9898 и ST78, но не штаммы B. tropicus JMT, поскольку последние не имеют гена lef (кодирует синтез летального фактора). Всё это явно добавляет путаницы ввиду необходимости держать в голове всю эту информацию. Конечно, для лабораторного исследования конкретного штамма сложностей не прибавится, но они точно возникнут у эпидемиологов, клиницистов и научных сотрудников, поскольку вполне вероятно, что одни специалисты будут относить эти штаммы к B. anthracis, а другие – к

B. cereus.

Что касается подвида cereus, то ситуация обстоит похожим образом. Те штаммы, что ранее были известны как «рвотные» B. cereus, обладающие генами цереулидсинтетазы (cesABCD), не принадлежащие к геномовиду B. mycoides, но разделяющие с типовым

B. cereus. Однако не совсем понятна история с биоваром Emeticus (кратко B. Emeticus), поскольку относящимся к нему является штамм, если он просто синтезирует цереулид или обладает генами цереулидсинтетазы (cesABCD), т. е. без значений ANI, а в качестве примеров таких штаммов указываются B. mosaicus subsp. cereus

(«рвотный» B. cereus) и B. mycoides («рвотный» B. weihenstephanensis).

77

Раздел I • 4. Штаммы из Кот-д’Ивуара и Камеруна

К биовару Thuringiensis предложено относить штаммы, синтезирующие один или несколько Bt-токсинов, то есть штаммы, известные исторически как B. thuringiensis.

С другой стороны, поскольку, как уже говорилось, внутривидовая таксономия не утверждена Международным комитетом по систематике прокариот, существуют и другие подходы. Например,

протоколом ВАМ (от англ. Bacteriological Analytical Manual) пред-

лагается использование микробиологических и биохимических тестов для отнесения штамма к B. cereus complex без необходимости проведения полногеномного секвенирования. В этом случае группа включает пять видов: B. anthracis, B. cereus ss, B. thuringiensis, B. mycoides и B. weihenspanensis(1). Несмотря на всю простоту и до-

ступность, а также привычность исследования фенотипа в лабораторной практике, этот подход исключает из группы общепринятые виды B. pseudomycoides, B. cytotoxicus и B. toyonensis.

Таксономия, предложенная Национальным центром по биотех-

нологической информации (National Center for Biotechnology Information), на начало 2024 года содержит уже 24 вида: B. albus, B. anthracis, B. bombysepticus, B. cereus ss, B. clarus, B. cytotoxicus, B. dicomae, B. gaemokensis, B. hominis, B. luti, B. manliponensis, B. mobilis, B. mycoides, B. nitratireducens, B. pacificus, B. paramobilis, B. paramycoides, B. paranthracis, B. proteolyticus, B. pseudomycoides, B. thuringiensis, B. toyonensis, B. tropicus, B. wiedmanni.

Анализ вариабельности консервативных генов, то есть изучение изменчивости тех генов, что медленнее других накапливают мутации (их ещё называют генами домашнего хозяйства), осуществляе-

мый с помощью монолокусного (SLST, от англ. single locus sequence

1 Выделен в 1998 году на основе анализа генома психрофильных штаммов B. cereus и B. mycoides, растущих при температуре 4–7 °C (в гене белков холодового шока cspA в позиции 4 имеется замена А→G). Назван по местности Вайенштефан на юге

Германии, где типовой штамм (WSBC 10204Т) был изолирован из молока (см. Lechner S., Mayr R., et al. Bacillus weihenstephanensis sp. nov. is a new psychrotolerant species of the Bacillus cereus group. Int

J Syst Bacteriol. 1998; 4:1373–1382; DOI: 10.1099/00207713–48–4–1373). Однако в 2018 году рядом исследователей отнесён к B. mycoides, поскольку метаболические, физиологические и хемотаксономические характеристики типового штамма B.

weihenstephanensis совпадают с таковыми у B. mycoides (см. Liu Y., Lai Q., et al. Genome analysis-based reclassification of Bacillus weihenstephanensis as a later heterotypic synonym of Bacillus mycoides. Int J

Syst Evol Microbiol. 2018; 68(1):106–112; DOI: 10.1099/ijsem.0.002466).

78

Мистерии сибирской язвы

typing) и мультилокусного (MLST, от англ. multilocus sequence typing) секвенирования, также применяется для внутривидовой таксономии. Чаще всего выбирают общие для филогенетической группы гены, которые, однако, не кодируют факторы вирулентности и патогенности1. Так, для SLST-типирования была предложена< 2 > последовательность гена пантоат-β-аланинлигазы panC, аллельный полиморфизм которой позволил разделить штаммы представителей B. cereus complex на генетические группы. К I и II группам относят соответственно штаммы B. pseudomycoides и B. wiedmannii. К III группе – штаммы B. anthracis с частью штаммов B. thuringiensis и эметическими («рвотными») штаммами B. cereus ss, тогда как остальные штаммы B. thuringiensis и B. cereus ss отнесены к IV группе. К V группе отнесены штаммы B. toyonensis, к VI группе – штаммы B. mycoides и B. weihenstephanensis, а к VII группе – штаммы

B. cytotoxicus. Примечательно, что штаммы этих групп также разделяются по так называемым термальным нишам (thermal niches). В частности, большая́ часть штаммов, входящих в группы II, V и VI, способна расти при температурах ниже 8 °С, тогда как большая́ часть штаммов, входящих в группы III и VII, наоборот, растут при 45–50 °С. Штаммы из группы I и IV способны расти в более широком диапазоне температур (10–43 °С). Всё это указывает на эволюционное приспособление штаммов к новым условиям: переход от термотолерантности (при 50 °С способны расти только штаммы VII группы) к психрофильности (при 5 °С способны расти только штаммы VI группы), то есть произошедший миллионы лет назад выход из ограниченной термальной ниши, характеризующейся высокой температурой (термальный источник, вулканическая почва), к более низким, таким как животные и невулканические почвы,

идалее вплоть до арктических регионов.

1Понятия «вирулентность» (т. е. способность выжить в макроорганизме), «патогенность» (т. е. разрушительность для макроорганизма) и «восприимчивость» (т. е. способность макроорганизма заразиться), как справедливо отметил советский врач, бактериолог Игорь Валерианович́ Домарадский́ (1925–2009), «нельзя отделять одно от другого, и если это делается, то только в методологических целях». При этом надо ска-

зать, что список факторов (детерминант) вирулентности и патогенности со временем меняется.

2Guinebretière M.-H., Thompson F. L., et al. Ecological diversification in the Bacillus cereus Group. Environ Microbiol. 2008; 10(4):851–865; DOI: 10.1111/j.1462–2920.2007.01495.x.

79