Мистерии сибирской язвы (учебник)

Мистерии сибирской язвы

◄ Рисунок Роберта Коха, изображающий полный цикл развития сибиреязвенного микроба (любезно предоставлено Robert-Koch-Institut). Поскольку цикл развития представлен не по порядку, можно предположить, что это зарисовки, сделанные во время серии экспериментов.

12 часов моложе. (4) и (7) Пустые области. (5) и (8) Тяжи бактериальной культуры (такие же тяжи можно наблюдать после обработки вегетативных клеток формалином). (6) и (9) Споруляция, идущая от края к центру. Обратите внимание, что крайние клетки Кох изобразил жирнее, что может свидетельствовать об их гибели, поскольку в препаратах мёртвые споры всегда выглядят темнее и чётче. (10–12) Различные бактерии, вероятно, тетракокки (10), актиномицеты (11) и спорообразующие бациллы (13)

Принято считать, что споровая форма является механизмом выживания, при котором бактерия, способная переходить в эту форму, «впадает в спячку» на время неблагоприятных условий, сохраняясь таким образом в окружающей среде в течение длительного времени. Однако применительно к B. anthracis и его ближайшим родственникам (B. cereus, B. thuringiensis) это утверждение следует расширить: показано, что возбудитель может присутствовать в почве и в вегетативной форме, поэтому можно предположить, что споруляция не только является формой защиты, но и повышает вероятность распространения (за счёт формирования жгутика на поверхности).

Процесс образования эндоспоры (называемой чаще для краткости просто «спора»; Рис. 2.2), длящийся примерно 8 часов, начинается с «решения о споруляции» – сложного механизма химических сигналов, который до конца ещё не изучен, – после которого бактериальная клетка начинает ассиметрично делиться1 на две сестринские клетки, отделённые друг от друга септой (перегородкой) и содержащие копии генома. Меньшую клетку принято называть преспора, а большую – материнская клетка. Последняя инициирует процесс миграции и слияния клеточных стенок по механизму, напоминающему фагоцитоз, посредством которого она через септу

1 То есть ближе к одному из полюсов клетки, а не посередине.

31

Раздел I • 2. Мир глазами Коха

Вегетативные клетки B. anthracis, сгруппированные в цепочки (А), и единичные, формирующие споры (В); сканирующая (А) и трансмиссионная (В) электронная микроскопия (изображения Muhsin Özel и Gudrun Holland (А), Lars Möller и Josef Schröder (В); любезно предоставлено Robert-Koch-Institut).

Сравните эти изображения с тем, что видел Роберт Кох

поглощает преспору, ядро которой теряет до 80 % влаги (обезвоживается). На поверхности ядра преспоры оказывается два плотно прилегающих слоя пептидогликана – внутренний (собственный) и внешний, доставшийся от материнской клетки. При этом внешний пептидогликан утолщается, образуя кору (cortex), тогда как внутренний, напротив, истончается до тонкой прослойки между ядром и корой, чтобы в будущем, в процессе прорастания споры, стать основой для клеточной стенки вегетативной клетки.

Надо сказать, что процесс «сборки» споры из преспоры в основном регулируется генами материнской клетки, чья транскрипция, как и транскрипция любого белка клетки, инициируется специальными белками, именуемыми сигма-фактор (σ-фактор), обеспечивающими связывание ДНК-зависимой РНК-полимеразы с промоторной областью ДНК. Так, фактор σЕ материнской клетки инициирует работу целого каскада генов, что в частности приводит к синтезу белка SpoIVA. Этот белок, изначально локализующийся вблизи септы со стороны материнской клетки (или непосредственно на ней), после поглощения материнской клеткой преспоры мигрирует на поверхность коры, где с другими белками вокруг неё образует белковую оболочку (coat). При этом прикрепление SpoIVA к поверхности септы обеспечивается взаимодействием с

32

Раздел I • 2. Мир глазами Коха

лируется непосредственно фактором σК. Интересно, что локализация белка SpoIVA является предпосылкой для локализации белка CotE, которым ограничена локализация предоболочки и с которого начинается сборка внешнего слоя оболочки (помимо этого минимум 40 % белков внешнего слоя оболочки контролируются этим белком), поэтому по его расположению внутри уже зрелой споры можно понять, откуда начиналась сборка.

Сама по себе оболочка обеспечивает защиту от большого количества химических веществ, в частности ферментов, к которым чувствительна кора, например, лизоциму, действие на кору которого приводит к гидролизу пептидогликана и, как следствие, гибели споры. Кроме того, оболочка устойчива к действию таких окислителей, как диоксид хлора, гипохлорит, озон, пероксинитрит и даже перекись водорода, но в малых концентрациях. Именно поэтому в лаборатории при работе со спорообразующими бактериями для дезинфекции используют именно 6%-ный раствор перекиси водорода. Интересно, что за исключением белка CotA, играющего ведущую роль в защите от перекиси водорода(1), для других белков оболочки прямой роли в обеспечении устойчивости не показано2.

Другой важной ролью оболочки является подавление раннего прорастания. Так, споры с неполными оболочками, искусственно изолированные из материнских клеток, нестабильны и прорастают спонтанно. С другой стороны, белки оболочки играют важную роль в «нормальном» прорастании. Так, CwlJ, сборка которого зависит от белка GerQ, контролируемого всё тем же CotE, является литическим ферментом коры, активируемым во время прорастания спор. Другой белок, YcsK (LipC), обладает липолитической активностью. Роль OxdD и CotR ещё не показана, но первый, вероятно, защищает прорастающую в земле спору от действия щавелевой кислоты, вырабатываемой грибковыми гифами, а второй – обеспечивает выживание в активированных макрофагах, поскольку он структурно похож на пататин-подобные фосфолипазы, обеспечивающие выжи-

1Этот белок также обеспечивает синтез меланинподобного тёмно-коричневого фермента у B. subtilis, играющего роль в защите от ультрафиолетового излучения.

2Хотя контролируемые CotE белки также не играют роли в устойчивости к лизоциму, мутанты, не способные синтезировать CotE, образуют споры, неустойчивые

клизоциму.

34

Мистерии сибирской язвы

вание и репликацию Toxoplasma gondii в активированных макрофагах за счёт подавления выработки азота1.

Далее происходит сборка следующего слоя, про который Кох писал, что он похож на «шарообразную стекловидную массу, которая выглядит как светлое узкое кольцо, окружающее споры». Через 10 лет, в 1886 году, Карл́ Флюгге́ 2 предложит<3> называть этот слой экзоспо-

рием (exosporium)4.

Экзоспорий, внешне похожий на шар, свободно окружающий оболочку(5), состоит из базального слоя, к которому крепятся ворсинки, и подповерхностного слоя, также именуемого параспоральным. Базальный слой (Рис. 2.3) имеет форму 2D-кристалла и образован сетью короноподобных структур (чашечек), состоящих из α- спиралей богатых цистеином белков, преимущественно CotY и ExsY. Дно чашечек местами запечатано, а местами открыто, что обеспечивает полупроницаемый барьер с проходами диаметром около 20Å (читается: ангстрем) или 0,002 мкм. Таких отверстий вполне достаточно для прохождения низкомоллекулярных соединений, но слишком мало для диффузии таких крупных молекул, как белки. На поверхности базального слоя расположены ворсинки из высокоиммуногенных коллагеноподобных фибрилл, состоящих преимущественно из гликопротеина BclA, крепление которого обеспечивают белки ExsFA (BxpB) и ExsFB, однако точное место крепления фибрилл к базальному слою пока неизвестно. BclA содержит коллагенподобную область, к которой прикреплено множество идентичных пентасахаридов, содержащих антрозу. Этот необычный сахар, не встречающийся у других представителей Bacillus spp., синтезируется генами, активируемыми действием фактора σЕ, прикрепляется рамнозой (поэтому рамноза-отрицательные

1Вспомните, чем обеспечивается подавление азота в макрофагах у чумного микроба. Если забыли, то перечитайте Главы 6 и 13 Оперы о чуме.

2Karl Georg Friedrich Wilhelm Flügge, 1847–1923; немецкий (ганноверский) врач,

бактериолог, эпидемиолог, гигиенист. Автор работ по воздушно-пылевому и воз- душно-капельным путям распространения инфекций. Добился введения социальной гигиены в качестве университетского предмета.

3Flügge C. Die Mikroorganismen, 2nd ed. Leipzig: Verlag F C W Vogel, 1886.

4Отсутствует у многих спорообразующих бактерий.

5У B. anthracis и B. cereus он располагается примерно в 10–20 нм от поверхности оболочки.

35

Раздел I • 2. Мир глазами Коха

Рис. 2.3. Модель базального слоя экзоспория. Ворс схематически показан прикреплённым к выпуклой поверхности (по Kailas L., 2011; публикуется с разрешения the National Academy of Science, USA)

штаммы, соответственно, лишены антрозы) и обеспечивает поддержание конформационной структуры BclA и его устойчивость к протеолизу (т. е. разложению под действием протеаз). Поэтому даже голодающие клетки B. anthracis сохраняют способность синтезировать антрозу(1). Вместе с тем, когда антроза расположена экзогенно (транс-антроза), будучи прикреплённой к споре или свободно плавающей на её поверхности, она способствует передаче сигналов, подталкивающих вегетативные клетки к споруляции, и тем самым обеспечивает средство коммуникации между вегетативными клетками(2). Похожий на BclA гликопротеин, именуемый BclВ, обнаруживается в экзоспории (точная локализация неизвестна) и обеспечивает целостность его структуры, поскольку штаммы, не

1Вместе с тем существуют антроза-отрицательные штаммы, имеющие меньшую ворсистость за счёт отсутствия пентасахаридов, прикрепляемых антрозой, а также меньшую скорость прорастания споры.

2Интересно, что остатки сахаров со структурами, очень похожими на антрозу, обнаруживаются в капсуле штамма MR-4, отнесённого к Shewanella spp., а также в жгутиках Pseudomonas syringae (см. Kubler-Kielb J., Vinogradov E., et al. Saccharides cross-reactive with Bacillus anthracis spore glycoprotein as an anthrax vaccine component. PNAS. 2008; 105(25):8709–8712; DOI: 10.1073/pnas.0803897105.). Оба неродственных грамотрицательных микроорга-

низма встречаются, соответственно, в почвенных и растительных средах, поэтому нельзя исключать их возможное сигнальное взаимодействие со спорами сибиреязвенного микроба.

36

Мистерии сибирской язвы

способные его синтезировать, формируют хрупкий, легко разваливающийся экзоспорий.

Подповерхностный слой чаще всего является фрагментарным и имеется не у всех спор, а его архитектура повторяет архитектуру базального слоя, но с меньшими и более плотно упакованными короноподобными структурами.

Сборка экзоспория начинается сразу же после завершения поглощения преспоры материнской клеткой и активации фактора σК, то есть он формируется одновременно с корой и оболочкой. Всё начинается с того, что незадолго до поглощения белок CotY локализуется на септе, поэтому в момент поглощения преспоры материнской клеткой он оказывается на проксимальном полюсе преспоры, наложенным на белок CotE, чья локализация осуществляется с помощью SpoIVA 1 . Далее CotE направляет взаимодействие CotY с ExsY (синтезируется поздно, во время окна активности σК), что приводит к формированию так называемого проксимального «колпачка» (т. е. ближайшего к клеточной стенке материнской клетки), который как бы по «направляющим» расширяется на всё пространство вокруг оболочки до другого «колпачка», расположенного на противоположном, дистальном, полюсе преспоры (механизм его образования пока неизвестен). Этот механизм ещё называют «крышка с бутылкой». Важно понимать, что построение «направляющих» регулируется CotE, и именно комплексным взаимодействием всех трёх белков во время расширения формируются бороздки, покрывающие поверхность экзоспория 2 (Рис. 2.4 –

Рис.2.6).

Описанное расширение происходит настолько интенсивно, что «колпачки», лежащие на оболочке, как бы «отрываются» от неё, ввиду чего между экзоспорием и оболочкой образуется пространство. Поскольку среди белка CotE, расположенного в нижнем слое

1Именно поэтому штаммы, не способные синтезировать SpoIVA, формируют только фрагменты экзоспория, заполняющие всё пространство материнской клетки.

2Примечательно, что хотя процесс сборки экзоспория у всех близких родственников сибиреязвенного микроба схож, расширение «колпачка» у B. cereus происходит разнонаправленно, поскольку «направляющие» как бы спутаны между собой, что, вероятно, и объясняет максимальную прочность экзоспория у этого вида среди близкородственных видов.

37

Раздел I • 2. Мир глазами Коха

Рис. 2.4. Архитектура поверхности сложенного фрагмента экзоспория

B. cereus (ближайший родственник сибиреязвенного микроба); сканирующая атомно-силовая микроскопия. Обнаруживается две поверхности (А и В) с участками упорядоченной (пунктирные белые стрелочки) и неупорядоченной (сплошные белые стрелочки) кристаллической решётки, которая, повидимому, состоит из массива структур в форме купола. При большей визуа-

лизации упорядоченной поверхности (С и D) обнаруживаются шипы из гексагонально плотно упакованных единиц диаметром около 8 μm. Изменение цвета от тёмного к светлому иллюстрирует изменение высоты от 100 до 10 μm (по Kailas L., 2011; публикуется с разрешения the National Academy of Science, USA)

Рис. 2.5. Архитектура поверхно-

сти экзоспория B. thuringiensis

(ближайший родственник сибиреязвенного микроба); сканирующая атомно-силовая микроскопия. Обнаруживается кристаллическая решётка, состоящая из гексагонально плотно упакованных вогнутых «чашечек», образующих сотовый узор (С), при этом на противоположной стороне экзоспориума обнаруживается иная кристаллическая решётка (В). Изображение В является увеличением квадратной области на изображении А, а изображения

Си D – увеличенными изображениями областей, указанных на

изображении В белой и чёрной стрелками соответственно. Изменение цвета от тёмного к светлому иллюстрирует изменение высоты от 80 до 15 μm (по Kailas L., 2011; публикуется с разрешения the National Academy of Science, USA)

38

Мистерии сибирской язвы

Рис. 2.6. Споры B. anthracis с бороздками на поверхности экзоспория. Две верхние правые споры лишены экзоспория, поэтому их поверхность выглядит гладкой (изображения M. Özel и G. Holland; любезно предоставлено Robert-Koch-Institut)

«колпачков», обнаруживается белок CotO, следует предположить, что он может способствовать «отрыву» (Рис. 2.7). При этом недавно была выдвинута теория<1>, согласно которой пространство заполнено внутренним полисахаридом, поскольку белки, формирующие «колпачок», локализуются на септе незадолго до поглощения преспоры материнской клеткой, ввиду чего после поглощения в пространство между ними и ядром преспоры попадает полисахарид септы, на поверхности которого дальше собирается экзоспорий, а под поверхностью – оболочка.

Таким образом, сформированный экзоспорий обеспечивает механическую защиту споры и её адгезию (т. е. прикрепление). Однако это не единственные его функции. Так, например, поверхностный белок Alr преобразует необходимый для прорастания L- аланин в D-аланин, тем самым ингибируя преждевременное прорастание, а аргиназа, конкурирующая с синтазой оксида азота за L- аргинин, снижает концентрацию последнего в макрофагах2 и, как

1Lehmann D., Sladek M., et al. Role of novel polysaccharide layers in assembly of the exosporium, the outermost protein layer of the Bacillus anthracis spore. Mol Microbiol. 2022; 118(3):258–277; DOI: 10.1111/mmi.14966.

2Аргиназа метаболизирует L-аргинин в L-орнитин и мочевину, тем самым снижая уровень аргинина, необходимого для синтеза оксида азота.

39