Мистерии сибирской язвы (учебник)

Раздел III • 28. Клиника B. cereus ss

та антибиотикотерапия (цефазолин и гентамицин внутривенно).

На 3-й день температура резко поднялась до 38,7 °С; пациент почувствовал озноб и усиление боли в руке, которая заметно увеличилась в размерах (из раны выделялась водянистая жидкость коричневого цвета). Анализ крови выявил лейкоцитоз (18,4 х 109/л при норме 4,5–10 х 109/л), повышение уровня креатинфосфокиназы (6416 Ед/л при норме 190–270 Ед/л) и лактатдегидрогеназы (284 Ед/л при норме 135–225 Ед/л). В моче обнаруживался миоглобин. Из тканей выделены грамположительные палочки, ввиду чего была заподозрена газовая гангрена, вызванная Clostridium perfringens.

Выполнена открытая ампутация выше локтя из-за ухудшения клинического состояния, в ходе которой в тканевых полостях не было обнаружено гноя. Исследование тканей подтвердило газовую гангрену с присутствием грамположительных палочек в мышечных тканях (со стороны раны), идентифицированных как C. perfringens. Антибиотикотерапия скорректирована путём замены цефазолина на пенициллин G, и начат протокол гипербарической оксигенации для предполагаемой гангрены, вызванной C. perfringens.

На 2-й послеоперационный день вид микроорганизма был уточнён на B. cereus ss, исследование которого выявило устойчивость штамма к пенициллину, ампициллину, метициллину, цефалотину и цефокситину. Антибиотикотерапия скорректирована, гипербарическая оксигенация прекращена. На 10-й день антибиотики отменены, пациент выписан.

Данный случай не является единственным и наглядно показывает, что источник инфекции и схожесть клинической картины могут приводить к неверной идентификации возбудителя(1), которая, в свою очередь, приводит к неверной тактике лечения. Тем не менее поскольку B. cereus ss распространён повсеместно, он становится этиологическим агентом различных кожных инфекций, возникающих вследствие получения открытых ран (в основном в военное

1 Газ, обнаруживаемый в ранах, в случае B. cereus ss, вероятно, является азотом, тогда как C. perfringens выделяет углекислый газ и водород.

380

Мистерии сибирской язвы

время), огнестрельных ранений, инъекции препаратов (наркотиков) и, реже, проведения операций. Кроме того, инфицирование раны может произойти из-за колонизации бинтов, пропитанной гипсом марли, а также антисептиков, таких как хлоргексидин, пови- дон-йод и этиловый спирт. Первичная кожная инфекция также возможна, поскольку возбудитель может проникать через микроскопические трещины в коже. Обычно она развивается у иммунокомпетентных лиц, контактирующих с землёй, и протекает местно, в виде

эриматозной флегмоны, папулы, язвы и даже струпа (Рис. 28.5). Механизм и причины инфицирования неизвестны.

Описаны единичные случаи эндокардитов и остеомиелитов у иммунонекомпетентных людей и героиновых наркоманов, причём первое состояние чаще всего развивается на фоне уже имеющихся сердечных патологий. Большой интерес также вызывает случай<1>, произошедший в Нагоя (Япония), когда у 71-летней женщины с инвазивным раком мочевого пузыря спустя 5 недель после установки постоянного уретального катетера развилась лихорадка, а из мочи стал высеваться B. cereus ss. Назначенная антибиотикотерапия (имипенем + циластатин) привела к выздоровлению на 4-й день.

Итак, можно видеть, что B. cereus ss является этиологическим агентом большого спектра состояний, нередко приводящих к ле-

1 Sato K., Ichiyama S., et al. A case of urinary tract infection caused by Bacillus cereus. J Infect. 1998; 36(2):247–248; DOI: 10.1016/s0163–4453(98)80032–7.

381

Раздел III • 29. Лабораторная диагностика B. cereus ss

тальным исходам, но чаще всего у младенцев и иммунонекомпетентных лиц. При этом мы рассмотрели только инфекции, вызываемые «классическими» штаммами, не затрагивая Bcbva и штаммы с сибиреязвенноподобными плазмидами, поскольку они и вызываемые ими инфекции уже были подробно рассмотрены в Главах 4 и 16. Тем не менее до сих пор некоторые специалисты относятся к B. cereus ss пренебрежительно, упрямо закрывая глаза на его патогенный потенциал. Однако, как уже отмечалось, не только B. cereus ss, но и весь B. cereus complex всё чаще преподносит сюрпризы, ставя новые задачи перед здравоохранением и предлагая простую истину: вчера не равно сегодня, а сегодня не равно завтра. Бактериальные возбудители живут своей жизнью. Они размножаются, и многие обмениваются генами. Вчерашний представитель нормофлоры сегодня вызывает инфекцию. И задача очень проста – вовремя увидеть и предотвратить. Конечно, не нужно в этом деле доходить до безумия и в каждой бактерии подозревать потенциально опасный патоген (всё-таки у них презумпция невиновности), но нужно уловить едва заметные предпосылки и вовремя среагировать. И в этом сложность профессии врача.

29 ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА B. CEREUS SS

Лабораторная диагностика состояний, вызванных B. cereus ss, в целом похожа на диагностику сибирской язвы. Исследованию подлежит клинический материал и образцы окружающей среды, работу с которыми осуществляют в лабораториях BSL-2, поскольку возбудитель относится к ПБА 2 группы опасности (риска) согласно Всемирной организации здравоохранения и к III группе патогенности (опасности) в России1. Такое положение объясняется тем, что он

может вызывать заболевание человека и животных, но вряд ли представ-

1 В США не входит ни в одну из категорий, поскольку не рассматривается как потенциальный агент биотерроризма.

382

Мистерии сибирской язвы

ляет серьёзнуо опасность<1>. Однако после предыдущей главы с этим утверждением хочется поспорить.

Лаборатории BSL-2 относятся к базовым и представляют собой герметичные помещения, разделённые на «чистую» и «заразную» зоны, оборудованные системами вентиляции с HEPA-фильтрами (класс Н11 на входе и класс H14 на выходе). И в целом они похожи на лаборатории BSL-3, только к ним, равно как и к сотрудникам в них работающим, предъявляются менее жёсткие требования.

Образцы клинического материала и объектов окружающей среды подготавливают и сеют на питательные среды, такие как мясопептонный бульон, LB-агар, мясопептонный агар, агар Хоттингера, кровяной агар. Оптимальной температурой инкубации является 30–37 °С, однако существуют штаммы, растущие при более низких или, наоборот, более высоких температурах2.

При выращивании в бульоне в течение суток происходит его помутнение с последующим просветлением и образованием тонкой плёнки, которая при встряхивании распадается на пристеночное кольцо и хлопьевидный осадок, опадающий на дно. Сибиреязвенный микроб, напомним, образует плотный осадок по типу комка ваты.

На чашках в первые сутки образуются восковые серебристобелые (иногда розовато-коричневатые) колонии с неровными краями, имеющие зернистую структуру (R-форма), примерно 5–10 мм в диаметре, которые к 48-му часу увеличиваются до 2 см, однако размер может варьироваться в зависимости от штамма (Рис. 29.1). Похожие колонии формируют штаммы Bcbva и антрозаотрицательные штаммы сибиреязвенного микроба, правда, последние растут медленнее из-за задержки в споропрорастании (Рис. 29.2). В косо проходящем пучке света можно видеть ровные края колоний, хотя в ряде случаев может встречаться структура,

1Laboratory biosafety manual. 3rd ed.. World Health Organization, WHO/CDS/CSR/LYO/2004.11, 2004, 181 p.

2Как и в случае B. anthracis, штаммы B. cereus ss, выделяемые из зоны вечной мерзлоты, не растут в жидких питательных средах, а на плотных, при температуре 37 , колонии образуются лишь к концу третьих суток. При температуре инкубирования от 5 до 12 рост возможен к 48 часу, а оптимум температурного роста располагается в диапазоне от 15 до 24 .

383

Раздел III • 29. Лабораторная диагностика B. cereus ss

Рис. 29.1. Культуры B. cereus ss и их окраска по Граму: верхний ряд – штамм C1, выделенный из ила пруда для разведения сомов и способный биоразлагать амоксициллин (по Duong-Nguyen T. A., 2022); средний ряд – штамм, выделенный с поверхности египетской железной руды (по Selim K. A., 2018); нижний ряд – штамм, вызвавший кожное поражение и проявляющий устойчивость к антибиотикам (по Esmkhani M., 2022)

384

Мистерии сибирской язвы

Рис. 29.2. Выращенные на агаре с овечьей кровью (слева) и окрашенные по Граму (справа) культуры антроза-отрицательного штамма B. anthracis из Нигерии (верхний ряд) и штамма B. cereus bv. anthracis (Bcbva) из Кот-д’Ивуара (нижний ряд), изолированного из останков дымчатого мангобея (Cercocebus atys), умершего в период с мая 1993 по август 1994 года (по Norris M. H., 2023).

Обратите внимание, как схожи колонии обоих штаммов на чашках, но как отличаются клетки в мазках. Сравните их с культурами «классических»

B. anthracis и B. cereus ss (подробнее о B. anthracis ant– и Bcbva мы говорили в Главах 2, 3, 7 и в Главе 4 соответственно)

похожая на львиную гриву, характерную для сибиреязвенных колоний (Рис. 29.3).

Для окрашивания по Граму готовят фиксированные мазки 1 из клинического материала и суточных агаровых культур. В первом случае можно видеть крупные (1–2 х 3–5 мкм) прямые или слегка

1 В лабораториях BSL-2, как правило, мазки фиксируют путём проведения в пламени спиртовки (горелки), однако видится целесообразным использовать фиксирующие растворы, применяемые для сибиреязвенных культур, как было описано в Главе 21.

385

трально, что позволяет их дифференцировать от сибиреязвенных. Аналогичный вид имеют мазки, приготовленные из суточных культур штаммов Bcbva, в то время как в мазках антроза-отрицательных штаммов сибиреязвенного микроба обнаруживаются длинные цепочки, состоящие из маленьких клеток (Рис. 29.2).

Для обнаружения жгутиков используют фиксированные мазки 12–18-часовых агаровых культур, которые затем окрашивают и микроскопируют при большом увеличении. Для этого аккуратно петлёй забирают культуру и помещают в пробирку с 2–3 мл физиологического раствора. Далее, петлю держат неподвижно примерно 2 минуты или осторожными движениями погружают 3–4 раза, чтобы не повредить жгутики. Дают отстояться 15–20 минут, после чего аккуратно помещают новую петлю в пробирку, и наносят одну каплю на предметное стекло (не размазывая!), и дают высохнуть. Фиксируют.

Для окраски по Лейфсону на предметное стекло наносят протравитель на 30–50 секунд1 или 3–5 минут2, после чего либо выдержи

1 В этом случае в качестве протравителя используют смесь из 15 г таннина, растворённого при нагревании в 48 мл воды, к которому добавляют 30 мл насыщенного водного раствора железного купороса и 6 мл насыщенного раствора, состоящего из

386

Мистерии сибирской язвы

Рис. 29.4. Мазки крови (слева) и аспирата передней камеры глаза (справа);

окраска по Граму (слева по Shimoyama Y., 2017, справа по Mursalin M. H., 2020)

вают при комнатной температуре в течение 15–20 минут, либо нагревают до появления паров, после чего промывают сильной струёй дистиллированной воды примерно 30 секунд и высушивают на воздухе. Далее наносят карболовый фуксин Циля или смесь, состоящую из 1 части насыщенного спиртового раствора фуксина и 10 частей дистиллированной воды (при медленном нагревании до образования паров). Промывают дистиллированной водой и высушивают. В результате бактериальные клетки и их жгутики окрашиваются в розово-фиолетовый цвет (Рис. 29.5).

Можно видеть, что жгутики окрашиваются за счёт осаждения на них солей железа, однако для этих целей можно использовать и соли серебра (окраска по Морозову). На фиксированный мазок наносят раствор, состоящий из 1 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл

фуксина в 96%-ном растворе спирта. Смесь хранят в стеклянной таре с притёртой крышкой в тёмном месте. Перед использованием фильтруют. Хотя смесь может храниться несколько месяцев, целесообразнее её готовить за 1–2 дня до использования.

2 В этом случае в качестве протравителя используют смесь из 20%-ного водного раствора таннина, 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина и 5,5 мл насыщенного на холоде водного раствора соли Мора (сульфата аммонияжелеза[II]). Смесь хранят в стеклянной таре с притёртой крышкой в тёмном месте. Перед использованием фильтруют. Хотя смесь может храниться несколько месяцев, целесообразнее её готовить за 1–2 дня до использования.

387

Раздел III • 29. Лабораторная диагностика B. cereus ss

Рис. 29.5. Визуализация жгутиков единичных клеток (слева) и

при роении (справа); окраска по Лейфсону (справа по Mursalin M. H., 2020)

формалина в 100 мл дистиллированной воды. Спустя минуту тщательно промывают дистиллированной водой. Наносят раствор, состоящий из 5 г таннина и 1 мл фенола в 100 мл дистиллированной воды1, и подогревают в течение 1 минуты до появления паров, после чего тщательно промывают дистиллированной водой. Снова нагревают мазок и на 1 минуту наносят раствор аммиачного серебра2, после чего тщательно промывают дистиллированной водой и высушивают. В результате бактериальные клетки окрашиваются в угольно-чёрный цвет, а их жгутики – в коричневый или янтарночёрный цвет на прозрачном или жёлтом фоне.

Окрашивают и иными способами. Способ Лёффлера: на фиксированный нагретый мазок наносят раствор, состоящий из 100 мл 20%- ного раствора водного таннина, 50 мл насыщенного на холоде водного раствора железного купороса и 10 мл насыщенного спиртово-

1Наталья Никифоровна Клемпарская предлагает использовать 2,5–3%-ный раствор таннина во избежание образования осадков.

2Способ приготовления: 5 г нитрата серебра растворить в 100 мл дистиллированной воды, после чего отлить 20 мл раствора в отдельный сосуд, а к оставшимся 80 мл по каплям прилить водный раствор аммиака (NH3·H2O) до растворения образовавшегося осадка и возникновения лёгкой опалесценции (если раствора аммиака добавлено много, то следует по каплям прилить первоначальный раствор из отлитых 20 мл). Полученный раствор развести в дистиллированной воде в соотношении

1 : 100.

388

Мистерии сибирской язвы

го раствора основного фуксина. Спустя 1 минуту осторожно промывают дистиллированной водой и немного высушивают, после чего наносят карболовый раствор фуксина и прогревают 2– 3 минуты. Тщательно промывают дистиллированной водой и высушивают. В результате бактерии окрашиваются в тёмнофиолетовый цвет, а жгутики – в бледно-фиолетовый или красный цвета. Способ Инуйе: на фиксированный мазок наносят раствор, состоящий из 100 мл 20%-ного раствора водного таннина, 50 мл насыщенного на холоде водного раствора железного купороса и 10 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина. Спустя 1 минуту осторожно промывают дистиллированной водой и наносят раствор Мюра1, прогревая 1,5 минуты. Тщательно промывают дистиллированной водой и высушивают. В результате бактерии окрашиваются в тёмно-фиолетовый цвет, а жгутики – в бледнофиолетовый или красный цвет. Способ Бениньетти́ и Джино́ : за 2–3 дня до окраски приготавливают три раствора2, которые непосредственно перед окрашиванием смешивают в пропорции 1 : 2 : 3 и отфильтровывают. Далее наносят на фиксированный мазок и прогревают в течение 2–3 минут, после чего промывают дистиллированной водой и высушивают. В результате бактерии окрашиваются в тёмно-фиолетовый цвет, а жгутики – в бледно-фиолетовый цвет.

Для обнаружения спор используют фиксированные мазки из 2– 5-суточных культур или суточных культур, выращенных на голодном агаре. Окрашивают мазки по Цилю – Нильсену, кумасси синим или малахитовым зелёным по Шефферу – Фултону.

Для выявления реакции на ацетилметилкарбинол тестом Фогес́ –

Проскауэра́ , 2,5 мл суточной бульонной культуры переносят в отдельную пробирку и последовательно добавляют 0,3 мл первого

1Способ приготовления: смешать 25 мл насыщенного водного раствора сульфата алюминия-калия (алюмокалиевых квасцов) и 5 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина. Профильтровать непосредственно перед использованием.

2Первый раствор: 1 г сульфата цинка и 15 г таннина в 100 мл дистиллированной воды. Второй раствор: насыщенный водный раствор сульфата алюминия-калия (алюмокалиевых квасцов), полученный нагреванием. Третий раствор: насыщенный спиртовой раствор генцианвиолета.

389