Мистерии сибирской язвы (учебник)

Раздел II • 25. Молекулярно-генетические методы

Рис. 25.1. График амплификации с зарегистрированными сигналами (кривыми по каналам детекции), соответствующими фрагменту хромосомной нуклеотидной последовательности ssp, фрагменту нуклеотидной последовательности lef плазмиды рХО1 и фрагменту нуклеотидной последовательности capA плазмиды рХО2, а также внутреннему контролю образца (ВКО). Положительные контроли для наглядности опущены, горизонтальные линии – пороговая линия

свойства и «классическая» бактериология легко ответит на вопрос, чья же плазмида, однако на практике смерть пациента наступает быстрее, чем идентификация культур на чашке. Говоря языком цифр, медицина проигрывает в 86 % случаев. И в этой связи следует отметить главное: во-первых, ПЦР является экспресс-тестом, позволяющим с определённой долей вероятности быстро заподозрить инфекцию, вызванную сибиреязвенным микробом или атипичным представителем B. cereus complex; во-вторых, важный вклад в правильную постановку диагноза вносит грамотная работа хорошего эпидемиолога; наконец, в-третьих, необходимо продолжать поиски генетических маркеров, уникальных для B. anthracis(1).

1 В качестве мишеней недавно были предложены участки ВА_5358 и ВА_5361

хромосомного профага lambda_Ba03 (см. Низкородова А. С., Мальцева Э. Р., и др. Детекция

Bacillus anthracis по генам профага lambda_Ba03 посредством ПЦР в реальном времени. Проблемы особо опасных инфекций. 2022; 3:170–172; DOI: 10.21055/0370–1069–2022–3–170–172).

350

Мистерии сибирской язвы

В научных целях проводят анализ полиморфизма единичных нуклеотидов (SNP, single nucleotide polymorphism), при котором с помощью ПЦР оценивают вариабельность единичных нуклеотидов определённого локуса генома (так называемый однонуклеотидный полиморфизм), что позволяет, в частности, уточнять внутривидовую филогению. Вспомните, что именно на основе анализа 14 canSNP были определены три эволюционные линии для сибиреязвенного микроба (Глава 3).

Кроме того, изучают вариабельность так называемых тандемных повторов (tandem repeat), т. е. повторяющихся друг за другом участ-

ков ДНК. Мультилокусное VNTR-типирование (MLVA, от англ. multiple locus VNTR analysis) основано на изучении тандемных по-

второв, отличающихся по числу повторов (VNTR, от англ. variable number tandem repeat), а именно на ошибках, возникающих в процессе репликации VNTR. Для этого амплифицируют известные локусы c помощью ПЦР и сравнивают вариабельность VNTR с эталоном. В случае штаммов сибиреязвенного микроба, как правило, исследуют от 6 до 31 VNTR-локусов(1). Данный метод применяется в качестве самостоятельного или в сочетании с SNP, позволяя создавать геномные портреты штаммов с целью дальнейшего проведения расследований вспышек или изучения географии распространения штаммов. В частности, исследование штаммов, выделенных во время вспышек, произошедших осенью 2006 года в Моздокском районе Республики Северная Осетия-Алания (Россия) и весной 2007 года в Курском районе Ставропольского края (Россия), показало их принадлежность к одному MLVA-генотипу и свидетельствовало о происхождении из одного неблагополучного пункта< 2 >. С другой стороны, исследование изолятов из Монголии<3> и Италии<4>

1 Например, исследуют шесть хромосомных (vrrA, vrrB1, vrrB2, vrrC1, vrrC2,

CG3) и два плазмидных (pXO1, pXO2) локуса (см. Keim P., Price L. B., et al. Multiple-Locus Variable-Number Tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracis. J Bacteriol. 2000;

182:2928–2936; DOI: 10.1128/JB.182.10.2928–2936.2000).

2Рязанова А. Г., Еременко Е. И., и др. Использование методов молекулярного типирования Bacillus anthracis в Референс-центре по мониторингу за возбудителем сибирской язвы. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; 4(110):68–70; DOI: 10.21055/0370–1069–2011–4(110)–68–70.

3Okutani A., Tungalag H., et al. Molecular epidemiological study of Bacillus anthracis isolated in Mongolia by multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis for 8 loci (MLVA-8). Jpn J Infect Dis. 2011; 64(4):345– 348.

351

Раздел II • 25. Молекулярно-генетические методы

позволило определить их генетические связи, способ проникновения и географию распространения.

4 Fasanella A., Van Ert M., et al. Molecular diversity of Bacillus anthracis in Italy. J Clin Microbiol. 2005; 43(7):3398–3401; DOI: 10.1128/JCM.43.7.3398–3401.2005.

352

Раздел III

Bacillus cereus

sensu stricto

Раздел III • 26. Экология B. cereus sensu stricto

354

Мистерии сибирской язвы

26 ЭКОЛОГИЯ B. CEREUS SENSU STRICTO

1887 год. Супруги Франкланд́ , Перси́ Фарадей́ 1 и Грейс́ Кольридж́ 2 , занимаются выделением новых микроорганизмов из воздуха и воды. На одной из желатиновых пластин, оставленных в коровнике, они замечают образование большой колонии, в целом напоминающей рост открытого ранее B. subtilis, но «с той лишь раз-

ницей, что желатин разжижается быстрее». На агаре отличия были заметнее: колонии выросли влажные, серебристо-белые, гладкие, с

воскообразным налётом. «Даже на очень старых культурах не наблюдается морщинистости, а лишь лёгкая зернистость поверхности».

Однако и на желатине при очень тщательном рассмотрении заметны отличия. Так, при малом увеличении они «выглядят как круглые или овальные шерстяные массы с тонким шиповатым краем»

(Рис. 26.1-3b), от которого при дальнейшем культивировании начи-

нают отходить «длинные хлыстообразные и спирально закрученные нити» (Рис. 26.1-3с), впоследствии «приобретающие вид морской звезды, который легко виден невооружённым глазом».

«Мы установили с несомненностью, – продолжают супруги, – что все вышеперечисленные формы колоний происходят из одного и того же организма, поскольку мы неоднократно готовили чашки Петри путём инокуляции из отдельных колоний и снова получали колонии того же разнообразия по внешнему виду.

При капельном же выращивании в течение 12 часов наблюдается множество очень подвижных бацилл, в основном изолированных, но иногда образующих более длинные нити. Через 24 часа бациллы стали совершенно неподвижны, расположившись парами или нитями, по три-

1Percy Faraday Frankland, 1858–1946; британский химик, бактериолог. Член Ко-

ролевского общества (1891). Президент Химического общества (1911–1913). Автор работ по стереохимии и выделении чистых культур микроорганизмов. Скончался спустя 23 дня после смерти жены.

2Grace Coleridge Frankland, 1858–1946; британский бактериолог-самоучка и борец за право женщин заниматься наукой. Автор работ по бактериологии, а также научно-популярной книги Bacteria in Daily Life («Бактерии в повседневной жизни»).

В1904 году стала одной из 19 женщин, подписавших петицию в Химическое общество, в которой обосновывалась необходимость принятия в общество женщин.

355

Раздел III • 26. Экология B. cereus sensu stricto

Перси Фарадей Франкланд и Грейс Кольридж Франкланд

(любезно предоставлено The John Rylands Research Institute and Library, The University of Manchester)

четыре. Через 48 часов они всё ещё оставались неподвижными и наблюдалось обильное спорообразование, причём внутри каждого сегмента находилась блестящая овальная спора (Рис. 26.1-3а). Затем, по мере увеличения срока культивирования, нити постепенно распадались, а споры высвобождались...»

Так был открыта восковая бацилла или Bacillus cereus sensu stricto<1>. Распространена она повсеместно, но основной экологической нишей является почва. Именно тут проводит B. cereus ss свои будни, правда, чаще всего в виде спор, герминация которых обычно происходит при наличии свободной органики, в качестве которой выступают растения, останки животных, содержимое желудочнокишечного тракта пасущихся травоядных, а также содержимое кишечника некоторых червей, членистоногих и насекомых. И поскольку в отличие от сибиреязвенного микроба бактерия не спо-

1 Frankland P. F., Frankland G. C. XI. Studies on some new micro-organisms obtained from air. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 1887; 178:257–287; DOI: 10.1098/rstb.1887.0011.

356

Раздел III • 26. Экология B. cereus sensu stricto

питательные вещества. Исследования показывают<1>, что бактерия закрепляется в кишечнике обыкновенных мокриц (Porcellio scaber) в 70 % случаев. Также поступают и её ближайшие родственники –

B. thuringiensis и M. mycoides!

Обнаруживается B. cereus ss и в личинках различных насекомых, например, жёлтолихорадочного комара (Aedes aegypti) и зелёной мясной мухи (Lucilia sericata). Причём его роль в их жизни пока непонятна, поскольку в отличие от B. thuringiensis, некоторые штаммы которого синтезируют Bt-токсины, убивающие личинки (читайте: «переводящие» в состояние питательного субстрата), B. cereus ss не выделяет инсектицидных токсинов, и взаимоотношение, скорее всего, является симбиотическим. Эту мысль, в частности, подтверждает тот факт, что B. cereus ss часто выделяют от личинок медоносных пчёл (Apis mellifera), которых он защищает от инфекции,

вызываемой Paenibacillus larvae.

Однако нужно помнить, что бактерии могут выделяться не только из своих экологических ниш и B. cereus ss не является исключением, поскольку, в отличие от сибиреязвенного микроба, не «привязан» к рН почвы. Причём выделенные штаммы нередко обладают какими-то новыми, подчас удивительными, свойствами. Так, например, штамм B. cereus C1, выделенный из ила пруда для разведения сомов в провинции Чау Тхань (Вьетнам)<2>, способен разлагать амоксициллин, который применяют при разведении рыб. Штамм B. cereus RA23, выделенный из нефтешлама3,<4>, эффективно разлагает поливиниловый спирт, а штамм, выделенный из морской

1Swiecicka I., Mahillon J. Diversity of commensal Bacillus cereus sensu lato isolated from the common sow bug (Porcellio scaber, Isopoda). FEMS Microbiol Ecol. 2006; 56(1):132–140; DOI: 10.1111/j.1574– 6941.2006.00063.x.

2Duong-Nguyen T. A., Pham M. H., et al. Amoxicillin degradation ability of Bacillus cereus C1 isolated from catfish pond sludge in Vietnam. Heliyon. 2022; 8(11):e11688; DOI: 10.1016/j.heliyon.2022.e11688.

3Отходы, образующиеся в результате добычи, переработки и транспортировки нефти. Состоят из нефтепродуктов, воды и механических примесей (глина, песок, металлы), из-за чего представляют большую опасность для окружающей среды. Подавляющая часть нефтешламов подвергается захоронению.

4Ullah M., Li H., et al. Polyvinyl alcohol degradation by Bacillus cereus RA23 from oil sludge sample. 3 Biotech. 2019; 9(10):350; DOI: 10.1007/s13205–019–1882–6.

358

Мистерии сибирской язвы

воды в порту Сурабая (Индонезия), – дизельное топливо<1>. Штамм B. cereus HF10, выделенный из ризосферы тростника, произрастающего на побережье залива Ячжоу (Китай), значительно подавляет рост грибка Sclerotinia sclerotiorum, вызывающего гниль некоторых растений<2>. Штамм, выделенный с поверхности египетской железной руды, способен смещать изоэлектрические точки и за счёт высокого сродства к гематиту (Fe2O3) использоваться для эффективного обогащения железной руды благодаря отделению примесей кремнезёма<3>. Продолжать можно долго.

Вплоть до недавнего времени B. cereus ss рассматривался исключительно в качестве младшего безобидного брата сибиреязвенного микроба, поскольку, в отличие от него, не имел плазмид рХО1 и рХО2. Поэтому даже случаи выделения из клинического материала списывались на контаминацию. Тем не менее уже по прошлым главам Вы могли понять, что эта «лошадка» не так проста, поскольку существуют штаммы, имеющие схожие плазмиды, но которые за счёт синтеза экзополисахаридной капсулы оказываются ещё более вирулентными для человека и животных. Но о них мы уже говорили (если хотите освежить информацию в памяти, то это Главы 4 и 16), сейчас же настало время поговорить о «классических» штаммах, поскольку они также полны сюрпризов.

1 Kurniawan A., Wahyuni A. R. T., et al. Harnessing Bacillus cereus from Surabaya seawater for enhanced diesel fuel bioremediation in Tropical Ocean. Trends in Sciences. 2024; 21(7):7616; DOI: 10.48048/tis.2024.7616.

2Ma W., Ding J., et al. A novel strain of Bacillus cereus with a strong antagonistic effect specific to Sclerotinia and its genomic and transcriptomic analysis. Microorganisms. 2024; 12(3):611; DOI: 10.3390/microorganisms12030611.

3Selim K. A., Rostom M. Bioflocculation of (Iron oxide – Silica) system using Bacillus cereus bacteria isolated from Egyptian iron ore surface. Egyptian Journal of Petroleum. 2018; 27(2):235–240; DOI: 10.1016/j.ejpe.2017.07.002.

359