Мистерии сибирской язвы (учебник)

Раздел II • 24. Антибиотикочувствительность

когда агар подсохнет, с помощью пинцета 1 или автоматического диспенсера накладывают диски с антибиотиками на расстоянии не менее 15–20 мм между дисками и краями чашки (обычно не более 6 дисков на чашку диаметром 100 мм), слегка придавливая диски к агару. Чашку с дисками, а также засеянную чашку без дисков (контроль роста культуры) выдерживают при комнатной температуре 15 минут, после чего инкубируют (дном вверх) при 37 °С не более 18–20 часов.

Учёт результатов осуществляют путём измерения диаметра зон ингибирования роста бактерий (просветления в «сплошном газоне») и сравнения их с пограничными значениями, приведёнными в Табл. 24.1. Для этого чашки помещают на тёмную поверхность вверх дном, направляя луч света под углом 45°. При наличии зон с расплывчатыми краями или двойными контурами диаметр измеряют по наиболее чёткой границе.

Изучив таблицу, Вы, вероятно, несколько удивлены присутствию в ней цефалоспоринов I поколения, в частности, цефазолина и цефалексина, поскольку при обсуждении антибиотикотерапии они не упоминались (Глава 18). Действительно, хотя в отличие от цефалоспоринов II и III поколений к этим препаратам сибиреязвенный микроб чувствителен, и когда-то они использовались в лечении, последние исследования< 2 > показывают их эффективность только для постконтактной терапии и на ранних стадиях заболевания. Тем не менее культуры на чувствительность к ним исследуются, но исключительно на тот случай, если к остальным препаратам окажутся устойчивы (что, честно говоря, маловероятно). Аналогичным образом обстоят дела с канамицином, линкомицином и ломефлоксацином.

Следует добавить, что перед использованием новой партии диски проверяют с помощью референс-штаммов3 (Табл. 24.2) на среде

1После нанесения каждого диска его следует несколько утопить в среде, а пинцет

–фламбировать, чтобы не допустить вынос культуры из чашки.

2Sittner A., Bar-David E., et al. Closing the gaps: testing the efficacy of carbapenem and cephalosporin treatments of late-stage Anthrax in rabbits. Pathogens. 2024; 13(11):936; DOI: 10.3390/pathogens13110936.

3В качестве референс-штаммов (тест-штаммов) используют типичные штаммы с хорошо изученными свойствами, отличающиеся генетической стабильностью. В случае определения чувствительности к антибиотикам используют вакцинный

340

Мистерии сибирской язвы

Мюллера́ – Хинтон́ , поскольку диски, дающие меньшие или большие диаметры зон ингибирования, чем это установлено для рефе- ренс-штаммов, подлежат выбраковыванию (их использование может привести к получению невалидных результатов). Особенно опасна ситуация, когда бракованный диск даёт бо́льшую зону ингибиции, поскольку в этой ситуации имеется риск отнесения резистентного штамма к чувствительному.

Метод серийных разведений позволяет определить минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотика за счёт внесения его известного количества в питательную среду, чаще всего твёрдую (агар Мюллера – Хинтон, агар Гивенталя́ – Ведьминой́ ). Важным этапом для данного метода является приготовление основного раствора антибиотика, пригодного для хранения, и рабочего, который сразу будет использован для приготовления питательных сред. При этом допустимо использовать как жидкие, так и твёрдые питательные среды, но на практике применяют только твёрдые.

Для основного раствора используют субстанции с известной активностью (в экстренной ситуации допустимо использовать препараты, предназначенные для инъекций), которые взвешивают на аналитических весах с точностью до четвёртого знака и вносят в растворитель. Расчёт массы препарата (навески) осуществляют по формуле:

C∙V

mр = KA , [мг],

где С – необходимая концентрация препарата, мкг/мл; V – объём растворителя, мл; КА – активность препарата (количество активного вещества, содержащееся в используемой субстанции), мкг/мл.

На практике взвесить точное расчётное количество вещества невозможно, поэтому по традиции аналитической химии готовят навеску, близкую к расчётной, и пересчитывают необходимый объём растворителя по формуле:

штамм B. anthracis (например, СТИ), а также для внутреннего контроля качества определения антибиотикограммы – штамм Staphylococcus aureus ATCC 25923.

341

Раздел II • 24. Антибиотикочувствительность

mп ∙ Vт

Vп = mр , [мл],

где mп – практическая масса препарата (навески), мг; mр – расчётная масса препарата (навески), мг; Vт – объём растворителя, взятый для растворения расчётной навески, мл.

Следует отметить, что для ряда антибиотиков растворителем будут являться два вещества: солюбилизатор и разбавитель (Табл. 24.3). В таком случае препарат растворяют в минимальном объёме солюбилизатора и разводят до необходимого объёма разбавителем.

Для приготовления рабочих растворов из основного путём титрования получают нужные концентрации, используя в качестве растворителя дистиллированную воду. Вместе с тем если используются препараты в фасованном виде (ампулы, флаконы, таблетки), то приготовить рабочие растворы можно следующим образом.

В случае жидкой формы препарат растворяют в известном объёме дистиллированной воды. Например, если имеется флакон, содержащий 5 г вещества, то растворением его в 5 мл дистиллированной воды получим раствор концентрацией 10 0000 мкг/мл. Далее, путём титрования можно получить растворы концентрацией 10 000 мкг/мл, 1000 мкг/мл и так далее. В случае растворения в солюбилизаторе и разбавителе объём разделяют.

В случае твёрдой формы препарат размельчают до порошкообразного состояния и растворяют в известном объёме дистиллированной воды, учитывая поправочный коэффициент, равный отношению общей массы препарата к массе активного вещества. Например, если в таблетке массой 375 мг содержится 250 мг активного вещества, то поправочный коэффициент будет равен 1,5 (375 : 250). Тогда для приготовления раствора концентрацией 10 000 мкг/мл необходимо 15 мг порошка, полученного из таблетки, растворить в 1 мл дистиллированной воды.

Далее готовят чашки Петри с предварительно автоклавированным и остуженным до 48–50 °С питательным агаром, в который добавлены антибиотики, в двукратно увеличивающихся концен-

342

Мистерии сибирской язвы

трациях. Для этого в стерильные флаконы наливают по 20 мл агара и добавляют в них необходимое количество рабочих растворов (Табл. 24.4), начиная с наименьшей концентрации, после чего тщательно перемешивают и выливают в чашку.

С другой стороны, к 18 мл агара можно прилить по 2 мл рабочего раствора антибиотика в заранее приготовленных серийных разведениях, тщательно перемешать и вылить в чашки Петри. Таким образом конечная концентрация препарата в агаре будет в 10 раз меньше, чем концентрация вносимых серийных разведений рабочего разведения.

После высушивания чашки рекомендуется использовать немедленно или в течение суток при условии хранения при 4–8 °С. Непосредственно перед работой их подсушивают в течение 15 минут при 37 °С, чтобы избежать образования конденсата. Суспензию из суточной культуры сибиреязвенного микроба (подозрительных колоний) в физиологическом растворе (2 х 107 м. к./мл) наносят по каплям лёгким касанием пипетки (примерно 0,005 мл) на поверхность агара, начиная с наименьшей концентрации. Таким образом можно изучить до 20–50 штаммов (в том числе включить контрольный штамм, МПК для которого известны). Затем, через 10–15 минут, когда агар подсохнет, чашки (в том числе чашку без антибиотика для контроля роста культуры) инкубируют (дном вверх) при 37 °С не более 18–20 часов. Учёт результатов осуществляют путём сравнения минимальной концентрации препарата, подавляющей рост возбудителя (т. е. МПК), с пограничными значениями, приведёнными в Табл. 24.1.

По итогам тестирования обоими методами исследуемый микроорганизм относят к одной из категорий категории:

чувствительный, т. е. применение антибиотика в рекомендуемых дозах приведёт к подавлению роста и размножения штамма;

промежуточный, т. е. применение антибиотика приведёт к подавлению роста и размножения штамма только при максимально допустимых дозах, при этом не исключается отбор вариантов возбудителя, для которых даже максимальные дозы окажутся неэффективными;

343

Раздел II • 24. Антибиотикочувствительность

устойчивый, т. е. применение антибиотика в рекомендуемых дозах не приведёт к подавлению роста и размножения штамма, и, следовательно, использование этого антибиотика для лечения недопустимо.

Важно помнить, что клинически ориентированные категории чувствительности и проверенная устойчивость к антибиотикам не всегда коррелируют. Поэтому, даже если есть улучшение на фоне назначенной терапии, через 2–3 суток необходим бактериологический контроль эффективности этиотропной терапии (посев, биопроба). Кроме того, увеличение МПК для исследуемых штаммов по сравнению с контрольным может указывать на тенденцию к нарастанию устойчивости их к антибактериальным препаратам, что требует изменения схемы лечения.

Табл. 24.3. Расворители для антибиотических препаратов

344

Мистерии сибирской язвы

Табл. 24.4. Концентрации антибиотических препаратов,

345

Мистерии сибирской язвы

Табл. 24.2. Допустимые диаметры зон подавления роста для

контрольных штаммов

347

Раздел II • 25. Молекулярно-генетические методы

25 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Среди молекулярно-генетических методов наиболее популярным и распространённым в лабораторной практике является полимеразная цепная реакция, которая позволяет сравнительно быстро определить присутствие в пробе нуклеиновой кислоты искомого возбудителя. В нашем случае – ДНК B. anthracis (а также плазмид, но об этом чуть позже).

Отобранный материал (Глава 20), за исключением клинического материала, обрабатывают так же, как для бактериологического исследования (Глава 21), и отбирают по 0,1–0,2 мл водной фазы для дальнейшего исследования. Клинический материал специально не обрабатывают, но подготавливают для последующего выделения нуклеиновых кислот. Так, из кусочков органов и отделяемого язв с помощью предварительно фламбированных ножниц вырезают фрагменты массой 0,1–1 г (микроауптаты), которые помещают в фарфоровую ступку, куда прибавляют физиологический раствор в соотношении 1 : 10, после чего фрагменты аккуратно измельчают ножницами и растирают пестиком. Дают отстояться и отбирают по 0,1–0,2 мл надосадочной жидкости.

Далее, по 0,1 мл материала (если он потенциально содержит споры возбудителя) или одну петлю 18-часовой агаровой культуры сибиреязвенного микроба (подозрительных колоний) засевают в пробирки с 0,8 мл (для материала) или 0,9 мл (для культуры) бульона Хоттингера и инкубируют с аэрацией (т. е. с доступом воздуха) в течение 2,5 часов при 37 °С, обеспечивая таким образом герминацию (прорастание) спор. Затем добавляют пенициллин до конечной концентрации 100 ЕД/мл (для протопластирования клеток и облегчения лизиса)1,2 и инкубируют с аэрацией в течение 15 минут при 37 °С, после чего прогревают ещё 10–30 минут на твердотельном термостате или водяной бане при 100 °С.

1Обычно препарат фасуется во флаконы по 1 млн ЕД. Поэтому для получения нужной концентрации содержимое флакона растворяют в 100 мл дистиллированной воды, после чего 0,01 мл (10 мкл) добавляют в среду, доводя её чистой средой до 10 мл (можно изначально использовать 9,9 мл среды).

2В ряде руководств можно встретить концентрацию 1000 ЕД/мл.

348

Мистерии сибирской язвы

Затем подготовленный на предыдущей стадии материал, а также материал, изначально свободный от спор, по 0,1 мл переносят в отдельные пробирки, куда приливают лизирующий раствор, приготовленный на основе 6М гуанидинтиоционата (0,3 мл), или раствор коммерческого производства, входящий в состав набора для выделения нуклеиновых кислот, после чего прогревают 15 минут при 60 °С.

С этого момента пробы считаются обеззараженными, и их передают на этап выделения нуклеиновых кислот и далее на ПЦР, в результате которой нарабатывается значительное количество фрагментов ДНК возбудителя, содержащих наиболее консервативные участки1. Поиск именно этих участков до сих пор является одним из важных направлений исследований сибиреязвенного микроба. Почему? Вспомните Главу 4. Мы говорили, что из-за высокого хромосомного сродства с B. cereus ss, B. thuringiensis и иными сибиреязвенный микроб в последнее время часто уже рассматривают не как самостоятельный вид (подобно, например, чумному микробу), но как представителя B. cereus complex. Поэтому современные тестсистемы ориентированы на поиск не только хромосомных маркеров, но и плазмидных, в качестве которых чаще всего выступают участки pagA, lef, cya, capB и capA (Рис. 25.1). Если уже успели забыть, какие участки на какой плазмиде расположены, перечитайте Главу

3.

Однако идентификация этих участков подтверждает только присутствие плазмид, их включающих. Например, идентификация участков pagA и capC может свидетельствовать о присутствии в пробе соответствующих плазмид как сибиреязвенного микроба, так и штаммов Bcbva. Особо придирчивые возразят, что случаев заражения человека штаммами Bcbva не было. В этом случае приведём другой пример: идентификация участка pagA, которая может указывать как на присутствие в пробе ДНК авирулентного (вакцинного) штамма B. anthracis, так и ДНК штамма B. cereus G9241, ответственного за сибиреязвенную пневмонию сварщиков, чаще всего имеющую фульминантное течение и заканчивающуюся летальным исходом. Конечно, все эти штаммы имеют иные культуральные

1 Подробнее о ПЦР читайте в Главе 36 Оперы о чуме.

349