Мистерии сибирской язвы (учебник)

Оценивают безусловную смертельную дозу (DCL). Для этого взвеси, содержащие 100, 1000 и 10000 спор, вводят подкожно по 0,5 мл минимум трём животным (на каждую концентрацию). Наблюдение осуществляют 10 суток, исследуя органы павших животных (мазки-отпечатки и посевы).

Культура сибиреязвенного микроба признаётся вирулентной, если значения LD50 или DCL не превышают 10000 спор1.

Специфичность взаимодействия антигена с антителом долгое время оставалась единственным инструментом, позволяющим надёжно и быстро выявить возбудитель, а также оценить ход протекания инфекционного процесса и оценить напряжённость иммунитета у переболевших и иммунизированных. В последнем случае ставят кожно-аллергическую пробу с антраксином (гидролизатом вегетативных клеток B. anthracis), который вводят строго внутри-

1 Считается, что для белых мышей LD50 до 10 спор соответствует высоковирулентному штамму, 11–20 спор – вирулентному, 21–200 спор – умеренно вирулентному, 201–104 – слабо вирулентному, а свыше этого – авирулентному. Однако надо помнить о неоднородности чувствительности различных линий мышей. Так, линии DBA/2J и A/J являются чувствительными, тогда как линии CBA/J, BALB/cJ и C57BR/cdJ – устойчивые.

330

Мистерии сибирской язвы

кожно по 0,1 мл в область нижней трети внутренней стороны левого предплечья. В результате должна образоваться беловатая папула около 0,8 мм с чёткими границами. Далее, за счёт контакта введённого аллергена с IgE на поверхности базофилов происходит активация последних, приводящая в результате каскада ферментных реакций к дегрануляции и высвобождению медиаторов из гранул (гепарин, гистамин), то есть аллергической реакции в виде гиперемии и инфильтрации кожи спустя 8–12 часов у заболевших (переболевших и вакцинированных). Оценку результатов проводят по системе четырёх крестов:

Диагноз у контактных и наличие иммунитета подтверждается при наличии положительной реакции (от 2+ до 4+). Слабоположительная (1+) и сомнительная (±) реакции требуют повторной постановки пробы спустя 5–7 дней. Отрицательная реакция не исключает риска заражения, как и не свидетельствует об отсутствии иммунитета, поскольку положительная реакция наблюдается лишь у 82 % больных с острой формой заболевания и у 61 % вакцинированных.

Пробу с антраксином также ставят животным, для чего препарат вводят строго внутрикожно по 0,2 мл в область средней части

331

Раздел II • 23. Реакция «антиген – антитело»

наружной поверхности уха. В результате должна образоваться папула с чёткими границами, исчезающая через 15–20 минут. Оценку результатов проводят через 6–24 часа по системе крестов:

наличие инфильтрата и гиперемии больше 10 мм,

+

утолщение кожной складки на 3 мм и больше

наличие инфильтрата до 10 мм и слабой гиперемии

±

(может отсутствовать), утолщение кожной складки до 3 мм

отсутствие инфильтрата и гиперемии,

–

утолщение кожной складки не более чем на 2 мм

При наличии положительной (+) реакции животное подлежит изоляции. Сомнительная (±) реакция требует повторной постановки пробы в другое ухо спустя сутки. Если при повторной постановке результат оказывается сомнительным или положительным, животное подлежит изоляции. При отрицательной реакции животное признают здоровым.

Вкачестве аналога данной реакции in vitro предлагается<1> использовать тест на активацию базофилов методом проточной цитофлуориметрии, в котором в пробирки с испытуемой кровью добавляют антраксин и окрашивают смесью моноклональных тел к CD63 человека, конъюгированных с флюоресцирующей меткой. В результате в крови больных кожной формой сибирской язвы обнаруживается от 41 до 79 % активированных базофилов, а у вакцинированных – от 12 до 26 %.

В1911 году Альберто́ Асколи́ 2 разработал<3> метод, позволяющий обнаружить антигены сибиреязвенного микроба в экстрактах из клинического материала (струпьев язв больных), органов умерших людей и животных, объектов окружающей среды (шкур), включая загнивший биоматериал. Для постановки реакции, именуемой сейчас преципитация по Асколи́ , свежий биоматериал вы-

1Куличенко А. Н., Ракитина Е. Л., и др. Использование теста активации базофилов с антраксином для лабораторной (in vitro) диагностики сибирской язвы. Проблемы особо опасных инфекций. 2012;

3(113):86–88; DOI: 10.21055/0370–1069–2012–3–86–88.

2Alberto Ascoli; 1877–1957; итальянский химик, гигиенист.

3Ascoli A. Die Präzipitindiagnose bei Milzbrand. Centralbl Bakt Parasit Infect. 1911; 58:63–70.

332

Мистерии сибирской язвы

держивают в течение 18–20 часов при 37 °С и измельчают. Далее его заливают смесью из физиологического раствора и 0,3%-ного фенола в соотношении 1 : 10, после чего оставляют отстаиваться при комнатной температуре на 16–18 часов (холодная экстракция), либо кипятят в течение получаса (горячая экстракция). Важно понимать, что во втором случае часть преципитиногентов разрушается, поэтому имеется риск получения ложноотрицательных результатов, особенно учитывая, что в случае выделанных шкур на результаты реакции могут также повлиять кислоты и щёлочи, используемые для их выделки (оптимальное значение рН для постановки реакции должно находиться в пределах от 6 до 8).

Полученные экстракты фильтруют через предварительно смоченные физиологическим раствором фильтровальную бумагу или вату. Затем в узкие пробирки наливают по 0,2–0,3 мл прозрачной сибиреязвенной сыворотки, поверх которой осторожно наслаивают равное количество фильтрованного экстракта (лучше всего приливать экстракт по стенке, не допуская смешения с сывороткой). На границе между сывороткой и экстрактом в течение 15 минут должно появиться мутно-белое кольцо преципитации, свидетельствующее о присутствии в исследуемом материале искомого антигена (т. е. сибиреязвенного микроба). Поэтому этим же способом можно исследовать культуры. Для этого одну петлю суточной культуры ресуспендируют в 0,25–0,5 мл физиологического раствора и подвергают горячей экстракции, а учёт результатов проводят в течение 3 минут.

Позднее на основе данного метода была разработана реакция диффузной преципитации по Оухтерлони́ <1>, суть которой заключает-

ся в «переносе» реакции по Асколи на поверхность агара. В частности, на чашку выливают тонким слоем 1,5%-ный агарозный гель, из которого после затвердевания осторожно вырезают лунки, в которые помещают исследуемую пробу и антитело (антиген) в зависимости от того, на что исследуют пробу. В результате помещённые в лунки антиген и антитело диффундируют друг к другу, взаимодействуют и между лунками образуется тонкая полоска преципитата. Таким образом можно исследовать пробы на присутствие токсинов

1 Ouchterlony Ö. Antigen – antibody reactions in gel. Acta Pathol Microbiol Scand. 1949; 26(4):507– 515; DOI: 10.1111/j.1699–0463.1949.tb00751.x.

333

Раздел II • 23. Реакция «антиген – антитело»

сибиреязвенного микроба и даже обнаруживать антитела в крови больных.

Обнаружить возбудитель в крови можно также с помощью им-

муноферментного анализа (ИФА; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay), в частности непрямого неконкурентного гетерогенного ИФА или «сэндвича́ ». Суть этого метода заключается в том, что на твёрдый носитель (чаще всего дно лунки планшета) с иммобилизованными (т. е. прикреплёнными) антителами (Ат) к искомому антигену добавляют исследуемую пробу, потенциально содержащую антиген. Если проба его содержит, то при инкубации антигены (Аг) из пробы связываются с антителами, а непрореагировавшие компоненты реакции удаляются отмывочным раствором. Далее вносится конъюгат, представляющий собой специфические антитела (Ат*), меченные ферментом и способные связаться с антигеном (Аг). Непрореагировавшие компоненты снова удаляются промывкой. В итоге антиген из пробы оказывается как бы зажат между иммобилизованными антителами и конъюгатом, образуя «сэндвич»: Ат – Аг – Ат*.

Поскольку в качестве конъюгата используются моноклональные антитела, меченные пероксидазой хрена (или другой коммерческой пероксидазой), для визуализации «сэндвича» используют суб- стракт-индикаторный раствор, состоящий из перекиси водорода и вещества, окисляющегося при взаимодействии с пероксидазой и перекисью водорода, что приводит к окрашиванию раствора, которое оценивается визуально и фотометрически. В частности, при использовании 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМВ) раствор окрасится в синий цвет (длина волны 370–650 нм). Для остановки реакции используют серную или ортофосфорную кислоту.

Чаще всего с помощью «сэндвича» обнаруживают протективный антиген. Чувствительность такой тест-системы составляет примерно 0,001 мкг/мл. Предлагается также использовать метод для обнаружения летального фактора (в этом случае на твёрдом носителе иммобилизован фрагмент протективного антигена)<1>.

1 Mabry R., Brasky K., et al. Detection of Anthrax toxin in the serum of animals infected with Bacillus anthracis by using engineered immunoassays. Clin Vaccine Immunol. 2006; 13(6):671–677; DOI: 10.1128/CVI.00023–06.

334

Мистерии сибирской язвы

Для обнаружения антител используют непрямой неконкурентный ИФА, который в целом похож на «сэндвич», за тем исключением, что на твёрдом носителе иммобилизован антиген, ввиду чего схема приобретает следующий вид: Аг – Ат – Ат*. Чаще всего с помощью этого метода обнаруживают антитела к капсуле сибиреязвенного микроба, что позволяет отличить инфекционный процесс от «последствий» вакцинации (напомним, что вакцинные штаммы не синтезируют капсулу). Однако сообщается<1>, что антитела к капсуле могут быть обнаружены в результате воздействия иных представителей рода Bacillus. И даже обнаружение антител только к белку капсулы СарА (на твёрдом носителе иммобилизован фрагмент белка, названный СарА322)< 2 > не позволяет исключить ложноположительных результатов с атипичными B. cereus ss и Bcbva.

В качестве более дешёвой альтернативы применяют точечный твёрдофазный иммуноферментный анализ или дот-ИФА (ДИА, dotELISA), в котором в качестве твёрдого носителя используют нитроцеллюлозную подложку с нанесённым на неё в виде точек антителом (антигеном), помеченным цветной меткой. В результате реакции образуются цветные пятна, легко различимые на белом фоне, что исключает необходимость использования фотометра. Существующие дот-ИФА позволяют обнаружить протективный антиген<3>.

Сыворотку инфицированного человека (подозрительного на инфицирование) можно исследовать методом флуоресцирующих антител (о нём мы уже говорили в Главе 21). Для этого готовят фиксированные мазки из суточной культуры вакцинного штамма (допускается хранение в холодильнике в течение 3 суток), на которые наносят сыворотку, предварительно инактивированную добавлением мертиолята натрия (1:10000) и инкубированную на водяной бане

втечение 20 минут (в качестве контроля используют сыворотку

1Harrison L. H., Ezzell J. W., et al. Evaluation of serologic tests for diagnosis of anthrax after an outbreak of cutaneous anthrax in Paraguay. J Infect Dis. 1989; 160(4):706–710; DOI: 10.1093/infdis/160.4.706.

2Zorigt T., Furuta Y., et al. Development of ELISA based on Bacillus anthracis capsule biosynthesis protein CapA for naturally acquired antibodies against anthrax. PLoS One. 2021; 16(10):e0258317; DOI: 10.1371/journal.pone.0258317.

3Sastry K.S.R., Tuteja U., et al. Identification of Bacillus anthracis by a simple protective antigen-specific mAb dot-ELISA. J Med Microbiol. 2003; 52(Pt 1):47–49; DOI: 10.1099/jmm.0.05027–0.

335

Раздел II • 23. Реакция «антиген – антитело»

крови здорового человека). Стёкла помещают на дно чашки Петри, закрывают крышкой и выдерживают 20–30 минут при 37 °С, после чего промывают (по 10 минут) двукратно физиологическим раствором и однократно дистиллированной водой. После высыхания на мазки наносят сыворотку (сибиреязвенные люминесцирующие иммуноглобулины против иммуноглобулинов человека) и помещают в чашку Петри с комочком влажной ваты (так называемая влажная камера), выдерживая 20 минут при 37 °С. Затем дважды тщательно промывают физиологическим раствором (по 10 минут), дистиллированной водой и высушивают. Исследуют под иммерсионным маслом, как описано в Главе 21.

Реакция непрямой (РНГА) или пассивной (РПГА) гемагглютинации

также используется для обнаружения антител к протективному антигену сибиреязвенного микроба в сыворотке крови, в частности, для определения антител в крови вакцинированных людей и животных. В данном случае реакция основана на способности специфического склеивания (гемагглютинации) эритроцитов, сенсибилизированных (нагруженных) специфическим антигеном, с материалом, содержащим антитело. При этом результат реакции наблюдается в виде выпадения на дно лунки планшета склеенных эритроцитов.

Для постановки реакции в минимум восемь лунок U-образного планшета вносят по 200 мкл физиологического раствора, после чего в первую лунку вносят 200 мкл исследуемой сыворотки крови и титруют до седьмой лунки. Затем во все лунки вносят по 50 мкл сибиреязвенного антигенного эритроцитарного диагностикума (восьмая лунка без пробы – контроль самоаглютинации сыворотки). Затем планшет аккуратно встряхивают (шуттелируют) для смешения компонентов и выдерживают 1,5–2 часа при комнатной температуре (от +10 до +20 °С). Схема метода приведена в Табл. 23.1. Постановка считается валидной, если в контроле (восьмой лунке) отсутствует гемагглютинация, то есть видны маленькие колечки или пуговки на дне лунки. При отрицательном результате гемагглютинация отсутствует (как в восьмой лунке), а при положительном – эритроциты располагаются на дне равномерным слоем (зонтики). Учёт положительного результата также рассматривают в системе четырёх крестов:

336

Мистерии сибирской язвы

эритроциты ровным слоем покрывают всё дно лунки

++++

(зонтик)

+++картина зонтика с загибающимися краями

++картина зонтика со слабо выраженным кольцом по краю

выраженное кольцо эритроцитов на фоне слабовыра-

+

женной картины зонтика

Результаты РНГА считают положительными, если положительный результат (не менее +++) обнаруживается в лунках, начиная с разведения 1:8 и выше.

Если набор включает дополнительные контроли (негативную и позитивную сыворотки), то во время постановки в отдельных лунках повторяют манипуляции: физиологический раствор – сыворотка (титрование) – диагностикум – инкубация. Далее оценивают результат, где в случае негативной сыворотки гемагглютинация должна отсутствовать, а в случае позитивной – присутствовать в лунках с титром не ниже 1:64.

Табл. 23.1. Схема постановки РНГА-Ат

Раздел II • 23. Реакция «антиген – антитело»

Похожим образом проводят реакцию латексной агглютинации

для идентификации сибиреязвенной капсулы или спор, в которой вместо эритроцитов используются полистироловые или полиакролеиновые латексные частицы размером 1,2–1,8 мм, нагруженные соответствующими антителами. Замена эритроцитов на латексные частицы позволяет значительно повысить устойчивость диагностикума. Чувствительность такой тест-системы в случае капсулы составляет примерно 0,001 мкг/мл (как при ИФА), а в случае спор – 2 х 106 спор/мл.

Вместе с тем самым простым и быстрым до настоящего дня остаётся иммунохроматографический анализ (ИХА, LFT, от англ. lateral flow test), суть которого состоит всё в той же реакции «антиген – антитело», осуществляемой путём миграции исследуемой жидкости по тест-полоске. Как и в случае латексной агглютинации, с помощью ИХА можно обнаружить капсулу сибиреязвенного микроба и споры. В этом случае исследуемая проба (аналит), содержащая антиген (Аг), наносится на тест-полоску и связывается с конъюгатом (Ат*) – меченным антителом, как правило, коллоидным золотом. Далее, комплекс Аг – Ат* мигрирует по полоске, встречая первый барьер, состоящий из специфических антител к искомому антигену. Образуется «сэндвич»: Ат – Аг – Ат*. Избыток конъюгата (Ат*) движется дальше, встречая второй барьер, где связывается с антителами к этому конъюгату (Ат’). Образуется комплекс: Ат’ – Ат*. В итоге, если в пробе содержался искомый антиген, цветные метки (Ат*) будут задержаны обоими барьерами, а если не содержался – только вторым барьером. Визуально это будет идентифицироваться как одна или две полоски, как правило, отмеченные буквами «Т» (тест) и «К» (контроль). Соответственно, любой результат, где отсутствует полоска контроля, считается невалидным. Интересной модификацией способа является ИХА на основе латексной полоски, позволяющей идентифицировать капсулу сибиреязвенного микроба<1> и споры<2>.

1Gates-Hollingsworth M. A., Kolton C. B., et al. Rapid capsular antigen immunoassay for diagnosis of inhalational Anthrax: preclinical studies and evaluation in a nonhuman primate model. mBio. 2022; 13(3):e00931– 22; DOI: 10.1128/mbio.00931–22.

2Кравец Е. В., Дугаржапова З. Ф., и др. Применение методов латекс-агглютинации и иммунохроматографии для ускоренной идентификации культур Bacillus anthracis при эпидемиологических расследованиях

338

Мистерии сибирской язвы

24 АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ

Исследование выделенной культуры на чувствительность к антимикробным препаратам (антибиотикочувствительность) является важным этапом лабораторной диагностики сибирской язвы. Как и в случае возбудителей иных особо опасных инфекций, оценку проводят с помощью диско-диффузионного метода (disk diffusion test), также именуемого методом Кирби – Бауэра (Kirby-Bauer test),

или метода серийных разведений.

Суть первого метода заключается в нанесении дисков с антибиотиками на агар, куда предварительно была засеяна тестируемая культура «сплошным газоном». Для этого предварительно автоклавированный и остуженный до 48–50 °С питательный агар разливают по 25 мл в чашки Петри диаметром 100 мм или по 20 мл в чашки диаметром 90 мм, чтобы толщина агара составляла примерно 4 мм, после чего оставляют для застывания при комнатной температуре. После высушивания чашки рекомендуется использовать немедленно или в течение суток при условии хранения при 4–8 °С. Непосредственно перед работой их подсушивают в течение 15 минут при 37 °С, чтобы избежать образования конденсата. В качестве среды чаще всего используют агар Мюллера – Хинтон (Mueller – Hinton agar), принятый в качестве «золотого стандарта», а также агар Хоттингера (рН 7,0–7,4) и агар Гивенталя – Ведьминой

(рН 7,2–7,6).

Диски с антибиотиками используются коммерческого производства и хранятся при минус 18 °С (используемые в работе обычно хранят при 4–8 °С). За час до работы флаконы с дисками вытаскивают из холодильника, чтобы не допустить попадания влаги из-за резкой смены температур во время открытия. Суспензию из суточной культуры сибиреязвенного микроба (подозрительных колоний) в физиологическом растворе (2 х 107 м. к./мл) по 0,3 мл наносят на агар и равномерно распределяют шпателем. Через 10–15 минут,

вспышек. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; 1(107):81–82; DOI: 10.21055/0370–1069– 2011–1(107)–81–82.

339