Мистерии сибирской язвы (учебник)

Раздел II • 22. Животные

В качестве альтернативы золотистых хомячков можно заражать методом втирания в кожу (австрийский метод). Для этого у животного выбривается часть тела на спине (2 х 3 см) и смачивается физиологическим раствором. Использовать раствор дезинфектанта строго запрещается,

Рис. 22.3. Скарификация кожи (насечки)

поскольку это может приве-

для заражения методом втирания сти как к гибели исследуемого микроорганизма, так и к

лишнему стрессированию животного. Животное подают строго горизонтально (спинкой вверх), чтобы исключить риск падения (соскальзывания) материала и его разбрызгивание. Кожу скарифицируют (Рис. 22.3), и на её поверхность с помощью пипетки наносят исследуемый материал, аккуратно втирая плавными движениями тупой стороной скальпеля под прикрытием чашки Петри.

Обычно гибель заражённых мышей наступает в первые двое суток, а морских свинок и хомяков – на третьи сутки или дольше. Если животное не пало на десятые сутки, его подвергают эвтаназии. Павшие и подвергнутые эвтаназии животные подлежат патологоанатомическому исследованию (вскрытию), которое проводят в соответствующем помещении блока – вскрывочной (секционной).

Для вскрытия подготавливают подложку (чаще деревянную), на которой размещают салфетку, обильно смоченную раствором дезинфектанта, ватные шарики (3 штуки), иглы для фиксации животного, ёмкость (стакан) с 96%-ным раствором этилового спирта, в которой помещаются ножницы и анатомический пинцет (хирургический может порвать ткани), а также спиртовку, корнцанг и контейнер с раствором дезинфектанта. Перед началом работы следует особое внимание уделить ножницам, которые должны быть острыми и иметь закруглённые бранши, поскольку от этого зависит качество выполняемой работы.

Процесс вскрытия лабораторного животного (хомячка) показан на схеме (Рис. 22.4), для наглядности дополненной фотографиями,

320

Мистерии сибирской язвы

и сводится к следующим этапам (номер этапа совпадает с номером на схеме и фотографиях):

1.С помощью корнцанга хомячка укладывают на расположенную на подложке салфетку, смоченную раствором дезинфектанта, брюшком вверх, после чего фиксируют конечности, слегка растягивая позвоночник. Подготавливают три ватных шарика, смоченных раствором дезинфектанта: одним, с помощью пинцета, обильно протирают место вскрытия (брюшко хомячка); вторым, сложенным в виде лодочки, прикрывают отверстие мочеиспускательного канала и используют для укладки в него извлекаемых органов; третий используют для очистки инструментария (пинцета и ножниц) от крови и шерсти животного.

2.Обрабатывают инструментарий фламбированием (окунают в ёмкость с 96%-ным раствором спирта и обжигают в пламени горелки; во избежание возгорания спирта в ёмкости следует размещать спиртовку на расстоянии), после чего в районе лобкового сочленения приподнимают кожу пинцетом и делают надрез ножницами. Далее бранши ножниц в сомкнутом виде вводят в пространство между кожей и брюшной стенкой по проекции средней линии до грудины и выводят, аккуратно размыкая их и смыкая таким образом, чтобы кожа отделилась от брюшной стенки.

3.Обрабатывают ножницы фламбированием и разрезают ими кожу по типу конверта (синяя линия) или фартука (красная линия), после чего её отгибают. На данном этапе оценивается состояние лимфатических узлов.

4.Обрабатывают ножницы фламбированием и разрезают брюшную стенку, повторяя операции 2 и 3.

5.Оценивают состояние внутренних органов.

6.При необходимости разрезают предварительно фламбированными ножницами грудную клетку (перекусив ножницами шейные позвонки, можно петлёй по позвоночному каналу взять образцы головного мозга), а также вскрывают черепную коробку для оценки мозга.

У павших от сибирской язвы животных в месте введения материала обнаруживается студенистый геморрагический отёк под-

321

Мистерии сибирской язвы

кожной клетчатки, который может затрагивать паховый лимфатический узел (Рис. 22.1 и Рис.22.4-3). Внутренние органы гиперемированы, селезёнка увеличена, а кровь местами несвёрнутая. Однако в жизни всё несколько сложнее. Так, у морской свинки, как говорилось ранее, могут отсутствовать какие-либо поражения (Рис. 22.5), тогда как у хомячков, напротив, патоморфологическая картина выраженная, но отличная от описанной: брюшная полость вздута и заполнена желеподобным экссудатом (Рис. 22.1 и Рис.22.6). Его так много, что в последние часы жизни «раздутый» хомячок не может шевелить задними лапами и передвигается (ползает) исключительно на передних! Видимых поражений органов нет, за исключением незначительного истощения селезёнки, но поскольку она изначально небольшая, заметить эти изменения бывает сложно.

Тем не менее для посевов на плотные питательные среды и приготовления мазков-отпечатков (с целью последующей окраски и микроскопирования) исследуют не только желеподобный экссудат

илимфатический узел, но также селезёнку, печень, сердце (кровь) и при необходимости лёгкие и головной мозг. Для этого используют предварительно фламбированные и тщательно остуженные пинцет

иножницы: от удерживаемого пинцетом органа отрезается ножницами фрагмент и свежим срезом делается несколько отпечатков по агару или стеклу. На агар, разделённый на секторы, обычно делают по два-три отпечатка. На стекло делают один отпечаток печени, два отпечатка лёгких, три отпечатка селезёнки, четыре отпечатка лимфатического узла и один мазок сердца (для этого отрезают верхушку сердца и отрезом проводят по стеклу), после чего стёкла помещают в фиксирующую жидкость на полчаса и окрашивают. Не забудьте, что фиксирующая жидкость состоит из смеси 96%- ного раствора этилового спирта и 6%-ного раствора перекиси водорода.

После завершения исследования при помощи пинцета ватные диски помещают на животное, снимают фиксаторы с конечностей и заворачивают углы салфетки конвертиком. Далее обёрнутое в салфетку животное с помощью пинцета помещают в контейнер для последующего обеззараживания и сжигания. Салфеткой, смоченной в растворе дезинфектанта, обрабатывается подложка (с обеих сторон) и поверхность стола, на которой она размещалась. В

323

Раздел II • 22. Животные

Рис. 22.5. Патологоанатомическая картина у морской свинки. Можно видеть отсутствие студенистого геморрагического отёка подкожной клетчатки, равно как и изменений в органах, включая головной мозг (изъятые селезёнка и головной мозг представлены в отдельных рамках)

324

Мистерии сибирской язвы

Рис. 22.6. Патологоанатомическая картина у хомячков, выраженная характерным «вздутием»

этот момент нелишним будет задержаться и подумать о безмолвном подвиге отважного животного, поскольку оно только что отдало свою жизнь ради спасения человечества.

Окраску мазков-отпечатков проводят с целью визуализации капсулы, обычно по М’Фадьену или Ребигеру, но также можно окрашивать способом Лю1,<2>. Для этого на фиксированный мазокотпечаток на 30–45 секунд наносят раствор LiuA, состоящий из смеси эозина и метанола, после чего на 90–120 минут наносят двойной объём раствора LiuB, состоящий из азура и метиленового синего, и аккуратно перемешивают путём выдувания воздуха из спринцовки. Излишки красителя осторожно смывают. В результате окрашивания бактериальные клетки окрашиваются в фиолетовый цвет, а капсула остаётся прозрачной с тонким фиолетовым ореолом на границе капсульного вещества (Рис. 22.7).

1 Предложена тайваньским гематологом Лю Хуэй ( , 1921–2001). Иногда

именуется окраской по Рю из-за японского прочтения фамилии.

2 : . , 1953; 52(6):348–352.

325

Раздел II • 22. Животные

Рис. 22.7. Ма-

зок-отпечаток селезёнки китайского трионикса, на котором видно капсулу (стрелки) штамма

B. tropicus JMT;

окраска по Лю

(по Tsai J.-M., 2023)

В окрашенных мазках сибиреязвенный микроб, как правило, располагается короткими цепочками, попарно или поодиночке. На чашках, инкубированных сутки, ищут колонии, характерные для сибиреязвенного микроба (как описано в Главе 21). В том случае, если чистая культура возбудителя получена из нативного материала раньше, чем пало животное, заражённое этим материалом, не дожидаясь его гибели, заражают ещё двух животных этой культурой, сутки инкубированной в бульоне.

Для ускоренного обнаружения способности к капсулообразованию заражают животное внутрибрюшинно, для чего его фиксируют и удерживают в вертикальном положении (головой вниз), чтобы органы брюшной полости сместились к диафрагме. Обработав кожу тампоном, смоченным физиологическим раствором, защипывают пинцетом кожу животного в правой нижней стороне брюшка, отступая примерно 0,5–0,8 см от белой линии живота, и несколько оттягивают (приподнимают вверх) до образования треугольной складки. Шприц с материалом удерживают горизонтально и, не меняя положения, вводят иглу в основание складки, при это ощущая прокол кожи и брюшины (ощущение провала иглы в пустоту). Далее надавливают на поршень шприца, вводя 0,5 мл подготовленного материала, после чего пинцетом берут тампон, накрывают место инъекции и вытаскивают иглу из кожи. В случае хомячков, ввиду их вёрткости, необходимо фиксировать все лапы,

326

Мистерии сибирской язвы

из-за чего защипнуть кожную складку пинцетом не представляется возможным. В этом случае у удерживаемого в вертикальном положении (головой вниз) животного оттягивают задние лапки и немного разводят в стороны, после чего вводят иглу шприца под углом 45° и надавливают на поршень шприца, вводя содержимое (Рис. 22.2-b). Спустя один или два часа после инъекции вскрывают животное и делают мазки-отпечатки экссудата брюшной полости, которые затем фиксируют и окрашивают (по М’Фадьену и Ребигеру).

В исследовательской практике иногда необходимо смоделировать кишечную и лёгочную форму заболевания, для чего материал вводят в желудок и в лёгкие. В первом случае (чрезпищеводное заражение) животное фиксируют и удерживают в вертикальном положении (головой вверх). Далее через ротовую полость вводят металлический зонд, представляющий собой загнутую металлическую трубку с утолщением у края в виде оливы, соединённый со шприцем (Рис. 22.2-с). Аккуратно надавливая на поршень, добиваются полного попадания жидкости в желудок животного. В случае заражения морских свинок и кроликов целесообразно использовать роторасширитель. Заражение через дыхательные пути осуществляется интраназально, для чего животное фиксируют в положении лёжа и седатируют до появления состояния лёгкого наркоза (прикладывают к носу кусочек ваты, смоченный простым эфиром или хлороформом). Далее материал вводят в носовые проходы небольшими каплями с помощью шприца на глубину 1–1,5

мм мышам, 2–3 мм – хомячкам, 4 мм – морским свинкам и кроликам. Время наблюдения и вскрытия зависят от поставленных в эксперименте задач.

Кроме того, осуществляют и внутримышечное заражение, для чего фиксируют животное в горизонтальном положении (брюшком вниз), фиксируя лапы (в случае хомячков задние лапы немного отводят в стороны). Затем вводят иглу шприца под углом 90° и надавливают на поршень шприца, вводя содержимое (Рис. 22.2-d).

Для оценки вирулентности (in vivo) исследуемую культуру отсевают на специальные среды, способствующие спорообразованию (например, картофельный агар), и инкубируют сутки при 37 °С, после чего инкубируют ещё 4–6 суток при 34 °С, контролируя про-

327

Раздел II • 22. Животные

цесс спорообразования окрашиванием мазков. При достижении 95–100 % спор культуру смывают с агара дистиллированной водой и полученную таким образом суспензию сохраняют при температуре 0–4 °С (холодильник) в течение 2–3 суток для лизиса оставшихся вегетативных клеток. Для определения концентрации спор готовят взвесь, содержащую 107 спор, сравнивая со стандартом мутности по МакФарланду́ 1 или с отраслевым стандартным образцом (ОСО), калиброванным в соответствии с Международным стандартом мутности образцов2. Затем титруют для определения реального количества спор в суспензии, способных к прорастанию (жизнеспособных спор) так называемым чашечным методом. Готовят 9 пробирок, содержащих по 4,5 мл 0,1–0,05%-ного раствора Твин-80 на дистиллированной воде. В первую пробирку вносят 0,5 мл споровой взвеси и тщательно перемешивают3, получая минус первое разведение (10-1) или концентрацию спор 108. Затем из этой пробирки переносят 0,5 мл во вторую пробирку и тщательно перемешивают, получая минус второе разведение (10-2) или концентрацию спор 107. Повторяют процедуру до получения разведений 10-6 и 10-7, из которых по 0,1 мл высевают на 6 чашек с агаром Хоттингера (по три чашки на каждое разведение), которые инкубируют сутки при 37 °С. На следующий день подсчитывают выросшие колонии и по среднему значению рассчитывают концентрацию спор в исходной смеси исходя из того, что одна выросшая колония на чашке произошла из одной живой споры. Подсчёт осуществляют по формуле:

1 Предложен американским врачом, бактериологом Джозефом́ МакФарландом́ (Joseph McFarland; 1868–1945) и изготавливается путём смешения 1%-ного раствора серной кислоты с 1,175%-ным раствором дигидрата хлорида бария, в результате чего

образуется сульфат бария (см. McFarland J. The nephelometer: an instrument for estimating the numbers of bacteria in suspensions used for calculating the opsonic index and vaccines. J Am Med Assoc. 1907; 49:1176–

1178).

2 Представляет собой взвешенные в дистиллированной воде частицы боросиликатного стекла (Pyrex®) диаметром 0,5–3,5 мкм. Стандарты выпускаются плотностью 5 МЕ и 10 МЕ, что для сибиреязвенных спор соответствует 5,5 х 104 м. к./мл (т. е.

микробных клеток в миллилитре) и 0,11 х 109 м. к./мл, соответственно (см. 5th International reference preparation of opacity, WHO International Standard, NIBSC code 76/522, Version 6.0

(2013), 2 p.).

3 Перемешивание осуществляют при помощи пипетки или дозатора путём засасывания и спускания жидкости для её перемещения внутри пробирки. Не забывайте, что для дальнейшего переноса жидкости в следующую пробирку необходимо сменить пипетку (наконечник дозатора)!

328

где N – количество колоний на чашке; ч1 и ч2 – количество чашек исследуемых разведений; d – коэффициенты разведений.

Подставив значения разведений и количества чашек, получим:

∑ N 3,3 ∙ 10−6.

Определив реальное количество спор в суспензии, приготавливают титрованием соответствующие разведения на физиологическом растворе по описанной методике. Взвеси, содержащие 1, 10, 100, 1000 и 10 000 спор, вводят подкожно по 0,5 мл четырём-шести животным (на каждую концентрацию). Наблюдение осуществляют 10 суток, учитывая количество павших животных в каждой группе. Затем оценивают 50%-ную летальность (LD50) по методу Рида́ и Менча́ . Для этого подсчитывают летальность, то есть отношение павших животных к выжившим (в процентах) в каждом разведении. Разведение, где летальность ниже 50 %, но максимально приближена к этому значению, именуется низшей критической зоной, а разведение, где летальность выше 50 %, но максимально приближена к этому значению, – высшей критической зоной. Например, для результатов, представленных в Табл. 22.1, видно, что ближайшими к 50 % будут разведения 10-4 и 10-5, поскольку летальность при этих разведениях соответственно равна 66,7 и 33,4. Соответственно, разведение 10-4 будет являться высшей критической зоной, а разведение 10-5 – низшей.

Далее, для определения LD50 пользуемся формулой:

где ВКЗ – разведение высшей критической зоны; ЛВКЗ – летальность высшей критической зоны, %; ЛНКЗ – летальность низшей критической зоны, %; k – коэффициент разведения.

Подставив значения нашего случая (поскольку разведения деся-

зом, разведение, 0,5 мл которого способно вызвать гибель 50 % заражённых животных, равно 10-4,5.

329