Мистерии сибирской язвы (учебник)

Раздел II • 21. Культура и её свойства

кращают и оставляют мазок на 2–3 минуты. Далее продолжают окраску по Цилю – Нильсену с промывки дистиллированной водой и обесцвечивания.

Существуют и другие способы окраски. Способ Пешкова́ : на фиксированный мазок наносят метиленовый синий «по Лёффлеру» и нагревают над пламенем горелки (до кипения) в течение 20 секунд. Далее мазок промывают дистиллированной водой и наносят 0,5%- ный водный раствор нейтрального красного на полминуты, после чего обильно промывают дистиллированной водой и высушивают. В результате бактериальные клетки окрашиваются в розовый цвет (хроматиновые элементы протоплазмы могут окрашиваться в фиолетовый), а споры – в голубой или синий (молодые споры могут окрашиваться в чёрный). Способ Мюллера́ : на фиксированный мазок наносят 5%-ный водный раствор хромовой кислоты на 1–3 минуты, после чего промывают дистиллированной водой и слегка просушивают. Наносят раствор фуксина и нагревают до появления паров в течение 3–4 минут. Наносят 5%-ный водный раствор серной кислоты на 5 секунд для обесцвечивания и промывают дистиллированной водой. Наносят метиленовый синий «по Лёффлеру» на 1–2 минуты, после чего обильно промывают дистиллированной водой и высушивают. В результате бактериальные клетки окрашиваются в синий цвет, а споры – в красный. Способу Виртца́ : на фиксированный мазок наносят смесь, состоящую из 5%-ного водного раствора малахитового зелёного и 5%-ного глицерина, и прогревают в течение 1 минуты до появления паров (примерно 3–4 раза). После остывания мазок промывают дистиллированной водой и наносят 0,5%-ный водный раствор сафранина. Через 30–40 секунд мазок промывают дистиллированной водой и высушивают. В результате бактериальные клетки окрашиваются в красный цвет, а споры – в тёмно-зелёный (лежащие в материнской клетке) или зеленоватоголубой (свободнолежащие). В модификации Савватеева́ вместо нанесения красок непосредственно на мазок используют заранее приготовленные фильтровальные бумажки, пропитанные краской1, которые кладут на мазок с предварительно нанесёнными на него 2– 3-мя каплями дистиллированной воды. В модификации Шеффера́ и

1 После пропитки бумажки высушивают (желательно при 50 °С), после чего хранят в закрытой таре в тёмном месте.

310

Мистерии сибирской язвы

Рис. 21.13. Визуализация спор методом (b) «раздавленная капля» и окрасками (а) по Цилю – Нильсену, (с) кумасси синим и (d) малахитовым зелё-

ным (d – по Zhang P., 2020)

Фултона́ используют малахитовый зелёный без глицерина, из-за чего лежащие в материнской клетке споры уже не визуализируются. Окрашивают и одним малахитовым зелёным, но это не очень эффективно (Рис. 21.13-d).

Можно видеть, что существующие способы окраски (и их модификации) сложны и весьма опасны получениями ожогов при работе с кипящими химикатами. В этой связи некоторые специалисты рекомендуют исследовать споры в раздавленной капле (Рис. 21.13- а), что уже опасно с точки зрения обеспечения биологической без-

311

Раздел II • 21. Культура и её свойства

опасности, поэтому видится целесообразным применять способ окраски, разработанный<1> сотрудниками Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (Оболенск) и автором этой книги. На фиксированный мазок наносят 0,1–1%-ный раствор кумасси синий G в 50%-ной уксусной кислоте на полчаса, после чего промывают дистиллированной водой и высушивают. В результате бактериальные клетки окрашиваются в светло-синий цвет, а споры остаются прозрачными (Рис. 21.13-с).

штамм считается нуждающимся в дополнительных факторах роста. В качестве контроля используют известные штаммы, например,

Ames или 81/1.

Дифференцировку культур по вирулентности (in vitro) осуществ-

ляют путём посева петлёй бляшками диаметром 3–4 мм суспензии спор или вегетативных клеток из суточной агаровой культуры на чашку со средой, содержащей противосибиреязвенный глобулин (например, средой «СОПЭК»), и на чашку с агаром Хоттингера (по 10–50 инокулятов). Параллельно, в качестве контроля, засевают: (1) культуру, достоверно продуцирующую капсулу и токсин (например, штамм Ames или 81/1); (2) культуру бесплазмидного штамма;

1 Хлопова К. В., Горшков-Кантакузен В. А., и др. К вопросу визуализации параспоральных тел и спор. Международный вестник ветеринарии. 2025. 3:84-89; DOI: 10.52419/issn2072-2419.2025.3.84.

312

Мистерии сибирской язвы

(3) культуру, продуцирующую капсулу на воздухе (т. е. с СО2- независимым механизмом синтеза). Чашку со средой, содержащей противосибиреязвенный глобулин, помещают в микроанаэростат (75 % воздуха) или СО2-инкубатор (10 % СО2) и инкубируют при 37 °С в течение 48 часов, после чего вынимают из микроанаэростата (СО2-инкубатора) и культивируют при 0–4°С (холодильник) в течение 1–3 суток. Чашку со средой Хоттингера и инкубируют при 37 °С в течение суток.

По окончании инкубирования чашки просматривают, регистрируя морфологию колоний. Шероховатые колонии с волокнистым краем (R-форма) характерны для штаммов, не продуцирующих капсулу, тогда как гладкие, блестящие колонии (SM-форма) – для продуцирующих. Для подтверждения капсулообразования далее проводят окраску (по М’Фадьену, Ребигеру). Чашку со средой, содержащей противосибиреязвенный глобулин, дополнительно просматривают на тёмном фоне для обнаружения колоний с характерным ореолом в виде тонких колец преципитации, свидетельствующих о токсинообразовании. Предварительную оценку проводят после 48-часового инкубирования, когда чашки переносят в холодильник. Учёт результатов представлен в Табл. 21.1.

Интересно, что ещё в 1960 году было предложено<1> подразделять все штаммы сибиреязвенного микроба на типы. К I типу были отнесены штаммы, формирующие колонии R-формы на воздухе и SM-формы в атмосфере СО2 (на бикарбонатной среде), и только в ней синтезирующие капсулу. Преимущественно это вирулентные штаммы. Ко II типу – штаммы, в любых условиях формирующие SM-форму и синтезирующие капсулу. Наконец, к III типу – штаммы, в любых условиях формирующие R-форму и не синтезирующие капсулу. Оба этих типа авирулентны. Считается, что III тип возникает спонтанно из I типа, поскольку последний склонен к диссоциации. Это явление особенно хорошо видно при культивировании на среде Green’а (10–75 % CO2). Выросшие колонии выглядят слизистыми, но постепенно среди них образуются колонии с «шероховатыми выростами» (Рис. 21.15), что объясняется селектив-

1 Thorne C. B. Biochemical properties of virulent and avirulent strains of Bacillus anthracis. Ann NY Acad Sci. 1960; 88:1024–1033; DOI: 10.1111/j.1749–6632.1960.tb20094.x.

313

Раздел II • 21. Культура и её свойства

ным преимуществом, появляющимся у бактерий этого типа при данных условиях культивирования.

Табл. 21.1. Интерпретация результатов (оценка вирулентности in vitro)

Рис. 21.15.

Диссоциация штамма на среде Green’а. Обратите внимание на крупные единичные колонии R-формы на фоне маленьких слизистых колоний SMформы

314

Мистерии сибирской язвы

С целью долгосрочного хранения выделенной культуры последнюю отсевают на питательные среды, способствующие спорообразованию (мясопептонный агар, агар Хоттингера, голодный агар, голодный пшеничный агар, голодный гороховый агар), после чего инкубируют в течение 4–7 суток при 37 °С, контролируя процесс спорообразования путём приготовления мазков и их окрашивания. По достижении 95–100 % спорообразования 1 культуру смывают дистиллированной водой и отстаивают в течение 3 суток (за это время должны погибнуть потенциально оставшиеся вегетативные клетки). Далее аккуратно удаляют надосадочную жидкость и приливают 30–50%-ный глицерин (химически чистый). В таком виде, в запаянных ампулах, споры могут храниться в течение нескольких лет при 4–8 °С.

Исследование выделенной культуры возбудителя на животных является неотъемлемой частью лабораторной диагностики. Работают с животными в специальных помещениях «заразной» зоны лаборатории, именуемых блоком для работы с инфицированными животными, которые отделяют от остальных помещений предбоксом (двери блока дополнительно оборудуются порогом не менее 30 см). В состав блока входят помещения для приёма животных из вивария, помещения для заражения, содержания и вскрытия животных, а также помещения для обеззараживания инвентаря. Несложно догадаться, что, как и в случае лаборатории, блок подразделяют на уровни и в нашем случае работы выполняют в блоке не ниже третьего уровня безопасности животных или ABSL-3 (от англ. Animal Biosafety level), соблюдая принцип парности2. Все манипуляции проводят в противочумном костюме I типа (аналоге),

1Следует иметь в виду, что для штаммов, выделенных из зоны вечной мерзлоты, эффективность закладки жизнеспособных спор составляет менее 30%.

2Подробнее о вивариях и блоке для работы с инфицированными животными читайте в Главе 34 Оперы о чуме.

315

Раздел II • 22. Животные

дополненном высокими сапогами, прорезиненным фартуком, нарукавниками и щитком.

В предыдущей главе мы говорили о пробоподготовке материала для посева на питательные среды. Этим же материалом параллельно заражают и биопробных животных, в качестве которых используют белых беспородных мышей, морских свинок или золотистых сирийских хомячков. Последние животные предпочтительнее, поскольку менее подвержены действию посторонней микрофлоры (мыши быстро умирают от сопутствующей инфекции, например, попавшей из корма) и им не свойственен разброс в индивидуальной реакции (как морским свинкам1), а также патологоанатомическая картина при сибирской язве у них более выраженная (Рис. 22.1). Однако надо учитывать, что молодые особи более устойчивы к действию возбудителя, и инфекционный процесс у них может протекать без видимых патологоанатомических изменений, поэтому при выборе золотистых хомячков в качестве биопробного животного приоритет следует отдавать более старшим особям (старше 3–4 месяцев).

Подготовленный материал суспендируют в небольшом объёме физиологического раствора и вводят подкожно в районе паха (в проекции лимфатического узла) или во внутреннюю поверхность бедра двум животным (прогретый и непрогретый материал): по 0,2–0,5 мл в случае использования мышей и по 0,5–1 мл в случае использования морских свинок и золотистых хомячков. Для этого исследуемый материал аккуратно набирают в шприц. Для удаления попавших пузырьков воздуха аккуратно двигают поршнем вперёд-назад (не допуская вытекания из иглы!), чтобы они переме-

1 Следует отметить, что многие специалисты отдают предпочтение морским свинкам, поскольку в их случае к летальному исходу могут привести не только штаммы, синтезирующие лишь один токсин (летальный или отёчный), но и даже те, что не способны синтезировать протективный антиген (РА-негативные). Вместе с тем они оказываются невосприимчивыми к некоторым атипичным штаммам сибиреязвенного микроба, в частности к штаммам с особыми питательными потребностями, к которым чувствительны другие животные. Кроме того, у них снижена восприимчивость к вакцинам на основе протективного антигена (AVA, AVP), но повышена чувствительность к некоторым антибиотикам. С другой стороны, они являются наиболее удачной моделью для исследования иммуногенных свойств адъювантов при вакцинации, поскольку полученные на них данные наиболее адекватно экстраполируются на человека.

316

Мистерии сибирской язвы

Рис. 22.1. Патологоанатомическая картина, характерная для сибиреязвенной инфекции у морской свинки (слева) и золотистого сирийского хомячка (справа), погибших на 2-е сутки инфекционного процесса (подкожное заражение). Можно видеть более выраженную патоморфологическую картину у хомячка, у которого обильнее кровенаполнено место инъекции

стились в район подыгольного конуса, после чего пинцетом на иглу накалывают небольшой стерильный бумажный пакетик с ватой или марлей, в который выгоняют воздух. Оставляют пакетик на иголке шприца непосредственно до момента заражения животного. Запрещается постукивать по цилиндру шприца или «спускать» воздух в раствор дезинфектанта.

Чистое животное, подготовленное для заражения, фиксируют. Фиксация мыши осуществляется путём извлечения из клетки (поимки за хвост) одной рукой и захвата другой рукой за холку защипывающим движением, при котором ушки животного прижимаются большим и указательным пальцами. Другая рука продолжает держать за хвост, слегка растягивая мышь. Фиксация морской свинки осуществляется путём захвата её одной рукой за спинку (под грудь), при этом большой и указательный пальцы охватывают шею, а остальные фиксируют конечности. Другой рукой удерживают зад-

317

Раздел II • 22. Животные

нюю часть тела, обездвиживая конечности. Фиксация золотистого хомячка в целом похожа на фиксацию мыши, но надо помнить, что хомячок более вёрткий и не имеет хвоста, поэтому его извлечение из клетки обычно осуществляют корнцангом за холку; другим корнцангом оттягивают заднюю лапку, противоположную месту введения инъекции. Однако целесообразнее использовать плотные перчатки (краги), защищающие от порезов и укусов, которыми ловят хомячка, после чего, удерживая за холку, фиксируют передние лапки.

Фиксированное животное подаётся в горизонтальном положении (хомячки – брюшком вверх). Экспериментатор в одну руку берёт шприц, а другой при помощи пинцета снимает пакетик с иглы шприца и опускает его в контейнер с раствором дезинфектанта. Этим же пинцетом берут тампон, смоченный физиологическим раствором, и протирают место инъекции, после чего кладут его на руку напарника, удерживающего животное, чтобы после заражения не производить лишних движений. В случае введения в паховую область защипывают пинцетом кожу животного и несколько оттягивают (приподнимают вверх) до образования треугольной складки. Шприц с материалом удерживают горизонтально и, не меняя положения, вводят иглу в центр складки, после чего надавливают на поршень шприца, вводя содержимое. В случае введения во внутреннюю поверхность бедра оттягивают лапу (в случае хомячков оттягивают обе задние лапы1) животного (пинцетом или рукой), после чего вводят иглу шприца под углом 15° и надавливают на поршень шприца, вводя содержимое (Рис. 22.2-а). Данную манипуляцию следует проводить аккуратно, чтобы не проколоть мышцу или брюшину, особенно у хомячков, чья кожа достаточно плотная и подвижная (для удобства шерсть можно заранее состричь). После введения содержимого пинцетом берут тампон, накрывают им место инъекции и вытаскивают иглу из кожи. Животное помещают обратно в клетку, а в шприц набирают раствор дезинфектанта и сбрасывают его в контейнер.

1 Оттягивание только одной лапы может привести к тому, что хомячок вывернется, даже будучи фиксированным. Поэтому целесообразно, чтобы одной рукой фиксировали передние лапы, а другой оттягивали лапу, противоположную к месту инъекции. Экспериментатор же свободной рукой оттягивает оставшуюся лапу.

318

Мистерии сибирской язвы

Рис. 22.2. Подкожное (а), внутрибрюшинное (b), пероральное (с) и внутримышечное (d) заражение хомячка

319