Мистерии сибирской язвы (учебник)

Раздел II • 20. Материал

Отбор проб почвы с места убоя больного телёнка из случая, описанного в Главе 16 (Рис. 16.11). Фотография любезно предоставлена

Сапарбаем Тезекбаевичем Жолдошевым

Пробы воздуха в объёме не менее 3–5 м3 отбираются специальными приборами, «прогоняющими» его через фильтры или сорбирующую жидкость.

Все пробы упаковывают с соблюдением принципа тройной упаковки1 и доставляют в лабораторию в течение суток при температуре 2–8 °С (образцы плазмы и сыворотки допустимо доставлять в течение 5 суток). Образцы биоматериалов, за исключением

1 Согласно этому принципу материал помещается в первичную ёмкость, водонепроницаемую и герметичную (банку, пакет, пробирку). Одну или несколько первичных ёмкостей помещают во вторичную тару, также водонепроницаемую и герметичную, содержащую достаточное количество адсорбирующего материала на случай повреждения (протечки) первичной ёмкости. Сюда же кладут одно из направлений (второе везёт лицо, осуществляющее доставку). Наконец, одну (реже несколько) вторичную тару помещают в наружную тару, содержащую достаточное количество амортизирующего вещества, минимальные размеры которой не могут быть меньше, чем 10 х 10 см. На упакованный материал составляется Акт упаковки, в котором указывается, что конкретно упаковано и как упаковано, а также Акт передачи патогенных биологических агентов. Подробнее об этом читайте в Главе 29 Оперы о чуме.

290

Мистерии сибирской язвы

крови, допускается транспортировать в течение недели при температуре минус 20 °С или дольше при температуре минус 70 °С. Допускается однократное замораживание – оттаивание.

Как видно из предыдущих глав, сибиреязвенный микроб являет-

ся патогеном, способным вызвать серьёзное заболевание у человека и животных, и он может легко распространяться, в частности быть легко доставленным до восприимчивого организма, как это было во время Amerithrax (Глава 15), способен вызвать общественную панику и социальные потрясения, а также требует специальных действий по обеспечению готовности общественного здравоохранения. Вместе с тем имеются достаточно эффективные способы лечения вызываемого им заболевания. По этой причине B. anthracis отнесён к патогенным биологическим агентам (ПБА) 3 группы опасности (риска) согласно Всемирной организации здравоохранения<1>, ко II группе патогенности (опасности) в России и к категории А в США, поэтому с отобранным для исследования материалом, как потенциально его содержащим, работают в изолированных (сдерживающих) лабораториях не ниже третьего уровня биологической безопасности или BSL-3 (от англ. biosafety level). Эти лаборатории являются герметичными инженерно-строительными конструкциями со сложной ограждающей (барьерной) системой, не допускающей «выход» ПБА. Они оснащены системой фильтрации воздуха и обеззараживания отходов, а работу в них выполняет квалифицированный персонал, обученный методам безопасной работы с ПБА, от профессионализма которого эпидемиологическое благополучие населения

1 Laboratory biosafety manual. 3rd ed.. World Health Organization, WHO/CDS/CSR/LYO/2004.11, 2004, 181 p.

291

Раздел II • 21. Культура и её свойства

зависит не меньше, чем от качества конструктивного выполнения лаборатории1.

Поступивший в лабораторию материал подлежит пробоподготовке для последующего бактериологического исследования. Кусочки органов и тканей, а также кусочки проб мяса измельчают ножницами или гомогенизатором, после чего заливают физиологическим раствором в соотношении 1 : 10. Полученную таким образом суспензию фильтруют или отбирают шприцем через марлевый тампон. Похожим образом подготавливают кусочки шкур, для чего их измельчают ножницами и помещают в ступку, после чего заливают физиологическим раствором в соотношении 1 : 10 и оставляют на 2–3 часа. По прошествии этого времени размякшие кусочки растирают пестиком до получения волокнистой мезги, которую отжимают о край ступки и удаляют. От проб шерсти отбирают наиболее загрязнённые фрагменты, которые измельчают ножницами, помещают в колбу (со всеми частицами грязи и пыли), заливают физиологическим раствором. Далее колбу закрывают и интенсивно встряхивают в течение 5–10 минут.

Пробы почвы освобождают от посторонних примесей (корней, камешков) и тщательно перемешивают, после чего отбирают около 100 г, которые помещают в колбу. Далее в колбу добавляют физиологический раствор или 0,5%-ный раствор пирофосфата натрия таким образом, чтобы получить около 20 мл суспензии. Колбу закрывают и интенсивно встряхивают в течение 5–10 минут, после чего дают отстояться 3–5 минут и отбирают надосадочную жидкость. Повторяют процедуру с половинным объёмом, то есть в колбу снова добавляют физиологический раствор или 0,5%-ный раствор пирофосфата натрия, получая уже 10 мл суспензии. После встряхивания и отстаивания надосадочную жидкость добавляют к надосадочной жидкости, полученной в первый раз, и центрифугируют 15 минут при 1000 об/мин. Полученный надосадок переносят в новый сосуд и центрифугируют 15 минут при 6000 об/мин для концентрирования микробной взвеси, которая, соответственно, уйдёт в осадок, поэтому его отбирают и ресуспендируют в 1 мл

1 Подробнее о подразделении ПБА на группы патогенности (опасности), устройстве лаборатории и методах безопасной работы (включая действия при возникновении аварии) читайте в Главах 27 и 30 Оперы о чуме.

292

Мистерии сибирской язвы

физиологического раствора. Аналогичным образом подготавливают различные порошкообразные вещества, включая корма и пищевые продукты.

Бактерии, содержащиеся в воде, концентрируют путём фильтрации через мембранные фильтры (3 мкм) с последующим соскабливанием осадка с фильтра или его измельчения ножницами. Допустимо центрифугирование в течение 15 мин при 6000 об/мин. Полученный фильтрованием или центрифугированием осадок ресуспендируют в 1–2 мл физиологического раствора. Если в пробе воды содержались фрагменты ила, то её предварительно фильтруют через 3 слоя марли.

Подготовленные таким образом пробы, за исключением проб, потенциально содержащих возбудитель в вегетативной форме (кровь, кусочки органов, тканей и мяса), делят на две части, одну из которых для избавления от посторонней микрофлоры прогревают при 80 °С в течение 20 минут на водяной бане, не допуская высыхания пробы.

Для выделения культуры («золотой стандарт») подготовленный непрогретый материал засевают на жидкие (бульоны), полужидкие (полутвёрдые) и твёрдые питательные среды. В частности, на чашки с мясопептонным агаром, агаром Хоттинегра (рН 7,2) и селективную дифференциально-диагностическую среду с 0,01%-ным раствором фенолфталеинфосфата натрия, а также пробирку с мясопептонным бульоном 1 . Материал, потенциально загрязнённый посторонней микрофлорой (корма, пробы почвы, смывы и проч.), следует наносить на чашки по 1–2 капли (0,1 мл) и тщательно растирать шпателем, перенося на вторую и третью чашки (метод истощения). Если материал не загрязнён (кровь, пунктаты, кусочки органов), то посев проводят шпателем без истощения либо петлёй. При этом некоторые специалисты рекомендуют наносить материал на половину чашки «площадкой», после чего, оторвав петлю (не обжигая), провести зигзагообразно для получения единичных колоний. Все посевы помещаются в термостат (дном вверх!) при температуре 36 °С на 18–20 часов. Если спустя это время рост не обна-

1 Рецептуры (прописи) питательных сред приведены в Приложении.

293

хлопья. Редко возможно появление диффузного роста, из-за которого при встряхивании образуются муаровые волны, а на поверхности может наблюдаться кольцо пристеночного роста. Из бульонной культуры делают высевы на чашки и инкубируют в течении 18– 20 часов.

Инкубированные чашки аккуратно вынимают из термостата в положении, параллельном поверхности стола (пола). Переворачивать их не рекомендуется из-за опасности возможного вытекания конденсационной жидкости, скопившейся на крышке (именно поэтому чашки помещались в термостат дном вверх). Если конденсата много, то крышку меняют путём аккуратного переноса дна чашки с культурой на новую крышку, после чего крышка с конденсатом также аккуратно помещается в раствор дезинфектанта. На чашках сибиреязвенный микроб формирует плоские матово-серые шероховатые колонии (R-форма), края которых при небольшом увеличении образуют так называемую львиную гриву (Рис. 21.2). Такие

1 Интересно, что штаммы, выделяемые из зоны вечной мерзлоты, не растут в жидких питательных средах, а на плотных, при температуре 37 , колонии образуются лишь к концу третьих суток. При температуре инкубирования от 5 до 12 рост возможен к 48 часу, а оптимум температурного роста располагается в диапазоне от

15 до 24 .

294

Раздел II • 21. Культура и её свойства

вносят в каплю, после чего, не обжигая петлю, из первой капли вносят во вторую каплю. Хотя это и не обязательно, таким образом можно получить менее густой мазок на случай, если первый окажется очень густым. Аккуратно укладывают полученный мазок на специальный планшет для предметных стёкол или чашку Петри с двумя спичками на дне для удобства взятия мазка, прикрыв крышкой до образования небольшой щели, чтобы мазки могли подсохнуть. Всё это, соответственно, располагается на поддоне с салфеткой, смоченной раствором дезинфектанта, рядом с горящей горелкой для соблюдения требований биологической безопасности. Строго запрещается подсушивать или фиксировать мазки в пламене горелки, поскольку это может привести как к спеканию исключительно поверхностно расположенных бактерий, так и к их аэрозолированию. Для фиксации мазки с помощью пинцета помещаются на полчаса в фиксирующую жидкость, для споровых культур состоящую из 96%-ного раствора этилового спирта и 6%- ной перекиси водорода. После фиксации мазки вынимают пинцетом и высушивают.

Мазки окрашивают по Граму́ <1>, для чего наносят раствор генцианвиолета2 на 1–2 минуты и тщательно смывают дистиллированной водой. Далее наносят раствор Люго́ля3 также на 1–2 минуты, смывают дистиллированной водой, на полминуты наливают 96%-ный раствор этилового спирта для обесцвечивания мазка и смывают дистиллированной водой. Наносят фуксин Пфейффера́ 4 (или саф-

1Gram H. C. Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnittund Trockenpräparaten. Fortschr Med. 1884; 2:185–189.

2Способ приготовления: растворить 1 г генцианвиолета в 10 мл 96%-ного раствора этилового спирта. Свежеприготовленный раствор перед использованием необходимо отстоять сутки при комнатной температуре или 2 часа при температуре 37 °С. Допустимо присутствие осадка.

3Предложен французским врачом Жаном́ -Гийомом́ Огюстом́ Люголем́ (Jean Guillaume Auguste Lugol; 1786–1851) в качестве препарата от туберкулёза. Способ приготовления: растворить 2 г йодида калия в 2 мл дистиллированной воды и после полного растворения добавить 1 г кристаллического йода. Энергично встряхивать до растворения йода, после чего добавить 300 мл дистиллированной воды, профильтровать.

4Предложен немецким врачом Рихардом́ Фридрихом́ Иоганном́ Пфейффером́

(Richard Friedrich Johannes Pfeiffer; 1858–1945) как модификация способа немецкого врача Франца́ Циля́ (Franz Ziehl; 1857–1926). Способ приготовления: к 1 г тщательно растёртого сухого основного фуксина прибавить небольшими порциями (растира-

296

Мистерии сибирской язвы

ранин) на 1 минуту, промывают дистиллированной водой и высушивают. Предпоследний этап (последовательное нанесение раствора Люголя и этилового спирта) может быть несколько сложен для начинающих специалистов, поэтому рекомендуется<1> заменить его на однократное нанесение так называемого йодированного спирта, приготавливаемого путём смешения 2–4 мл 10%-ного спиртового раствора йода с 100 мл 95%-ного раствора этилового спирта. Кроме того, для равномерного распределения красителя по мазку целесообразно сначала положить пинцетом кусочек фильтровальной бумаги и уже потом на него наносить краситель.

Весьма интересна модификация по Эткинсу. Для окраски готовят два красителя. На фиксированный мазок наносят первый краситель, состоящий из 96%-ного раствора этилового спирта и 1%-ного водного раствора сульфата анилина2 в соотношении 1 : 3, и через 1 минуту смывают дистиллированной водой. Наносят второй краситель, состоящий из 2 г кристаллического йода, растворённого в 10 мл 4%-ного раствора гидроксида натрия, и через 1 минуту наносят 96%-ный раствор этилового спирта для обесцвечивания. Через 5 минут наносят 10%-ный водный раствор сафранина, который смывают дистиллированной водой через 10 секунд.

В условиях мобильной лаборатории целесообразно использовать модификацию по А. И. Синёву. Для этого готовят раствор, состоящий из 1 г метилвиолета (или генцианвиолета), 5 мл глицерина и 100 мл 96%-ного раствора этилового спирта, которым после суточного отстаивания пропитывают полоски фильтровальной бумаги.

ется каждая порция) 5 г кристаллического фенола или добавить по каплям 5 мл 97%-ного водного фенола. Продолжая растирание, прибавить по 16–20 капель глицерина, затем 10 мл этилового спирта и довести небольшими порциями дистиллированной воды до 100 мл. Приготовленный раствор фильтруется (он должен иметь на поверхности плёнку металлического вида) и разводится дистиллированной водой

всоотношении 1 : 10.

1Розанов Н. И. Микробиологическая диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных: Руководство для ветеринарных врачей диагностических лабораторий. Москва: Государственное издательство сельскохозяйственной литературы, 1952, 508 с.

2Способ приготовления: к 100 мл 5%-ного водного раствора серной кислоты прибавить по каплям 20 мл технически чистого анилина (так называемое анилиновое масло). Выпавший рыхлый осадок отфильтровать и добавить в 30 мл 95%-ного раствора этилового спирта, после чего выпавший снова осадок отфильтровать и высушить. Далее растворить 1 г осадка в 100 мл дистиллированной воды.

297

Раздел II • 21. Культура и её свойства

Полученные полоски можно достаточно долго хранить в тёмной таре с притёртой пробкой. В отсутствие фильтровальной бумаги Наталья́ Никифоровна́ Клемпарская́ 1 предлагает использовать полоски газетной бумаги, пропитанные раствором, состоящим из 1 г генцианвиолета, 0,5 мл глицерина и 10 мл 96%-ного раствора этилового спирта. На фиксированный мазок наносят 2–3 капли дистиллированной воды, после чего с помощью пинцета накладывают полоску и слегка придавливают её к стеклу. Через 2 минуты полоску снимают и промывают мазок дистиллированной водой. Далее продолжают окраску по Граму с нанесения раствора Люголя, однако можно также использовать полоски, пропитанные соответствующими составами: для раствора Люголя – к 1 г кристаллического йода добавить 2,5 г йодида калия и 10 мл дистиллированной воды; для фуксина – к 0,1 г основного фуксина добавить 0,5 мл фенола.

В результате окраски обнаруживаются типичные однородные, довольно крупные палочки, окрашенные в фиолетовый цвет (Рис. 21.4). Это свидетельствует о том, что клеточная стенка сибиреязвенного микроба имеет дополнительный липополисахаридный (эндотоксический) слой (Рис. 2.8), прочно удерживающий фиолетовый краситель (генцианвиолет и йод) и не дающий спирту его обесцветить, что характерно для грамположительных бактерий (Г+). Обычно клетки располагаются длинными цепочками

(Рис. 21.4-а).

Помимо культур также окрашивают фиксированные мазки из патологического материала (в том числе от биопробных животных). В этом случае могут обнаруживаться короткие цепочки, состоящие из палочек с резко обрубленными концами. В материале от животных наряду с типичными могут присутствовать толстые, вздутые, короткие или, наоборот, узкие и длинные палочки, а также редко кокковидные, нитевидные, спиралеобразные и даже колбообразные. В материале от людей встречаются короткие, толстые, изогнутые, реже зернистые палочки, вздутые посередине или на одном из концов (Рис. 21.4-b,c). Важно помнить, что в крови возбудитель обнаруживается лишь незадолго до смерти, и в этом смысле

1 1914–2003, советский врач, бактериолог.

298