Мистерии сибирской язвы (учебник)

Раздел II • 19. Профилактика

гомогенной суспензии серовато-белого или желтовато-белого цвета с коричневым оттенком и переносят в стерильный флакон с физиологическим раствором из расчёта (0,5х – 1) мл, где х – количество доз в препарате (т. е. если используется ампула на 100 доз, то ресуспендированный лиофилизат переносят в 49 мл физиологического раствора). Область нижнего угла лопатки обрабатывают 70%- ным раствором этилового спирта или 5%-ным спиртовым раствором йода (10%-ным раствором йод-повидона). Вакцину вводят в

объёме 0,5 мл(1).

Вместе с тем подкожным способом допускается ежегодная вакцинация и здоровых взрослых животных (за исключением беременных на последнем месяце, а также в течение 7–10 суток после родов и хирургических вмешательств). Вновь вакцинированные животные подлежат изоляции от общего стада в течение двух недель. Овцам и козам вакцинацию осуществляют в область задней трети шеи или внутренней поверхности бедра. Крупному рогатому скоту, оленям, верблюдам, лошадям и ослам – в область задней трети шеи. Свиньям – в область внутренней поверхности бедра или за ухом, а пушным зверям – в область внутренней поверхности бедра или подхвостовое зеркало (т. е. похвостовую часть внутренней стороны бедра).

Молодняк с трёхмесячного возраста (жеребята с девятимесячного) вакцинируется двукратно с интервалом в 6 месяцев. Овцам, козам и пушным зверям в возрасте старше 3 месяцев, а также свиньям в возрасте от 3 до 6 месяцев вводят по 0,5 мл (109 спор), а свиньям старше 6 месяцев и крупному рогатому скоту, оленям, верблюдам, лошадям и ослам в возрасте старше 3 месяцев – по 1 мл (2 х 109 спор).

1 В качестве варианта подкожного способа введения рассматривают безыгольный (струйный), когда с помощью инъектора препарат вводится тонкой струйкой под давлением со скоростью около 222 м/с. Существуют споры относительно безопасности данного метода, тем не менее он весьма удобен для быстрой вакцинации больших контингентов, а вероятность обратного тока агентов «шприцевых» инфекций (против давления) видится маловерятной. Для обеззараживания части инъектора, соприкасающиеся с вакциной, погружают в 6%-ный раствор перекиси водорода с 0,5%-ным ПАВ (т. е. поверхностно-активного вещества) на один час при температуре не ниже 50°С.

280

Мистерии сибирской язвы

В 1986 году в стенах Всесоюзного НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии была разработана вакцина на основе штамма 55-ВНИИВВиМ, которая также применяется для вакцинации животных. Как и СТИ, она представляет собой лиофилизат спор, но может вводиться как подкожно (по схеме как для СТИ), так и внутрикожно. В последнем случае вакцинацию осуществляют крупному рогатому скоту, оленям и верблюдам в бесшёрстный участок промежности, лошадям и ослам – в область задней трети шеи, овца и пушным зверям – в подхвостовое зеркало, а свиньям – за ухом. Вводят по 0,2 мл крупному рогатому скоту, оленям, верблюдам, лошадям, ослам и свиньям, а по 0,1 мл – овцам и пушным зверям. Убой на мясо допустим не ранее чем через 10 дней после вакцинации1.

Ещё одной живой вакциной, рекомендуемой Всемирной организацией здравоохранения для вакцинации людей, является вакцина на основе штамма A16R, полученного в Китае действием ультрафиолетового излучения на штамм А16. Вакцина представляет собой суспензию спор (4 x 109/мл) в 50%-ном водном растворе глицерина, которую хранят при температуре 2–10 °С. Иммунизацию взрослых проводят накожным способом. Важно, что вскрытую ампулу с вакциной следует использовать в течение 3 часов. Как и в случае вакцины СТИ, на кожу наносят две капли вакцины на расстоянии 2–3 см друг от друга. Кожу слегка натягивают и скарификатором (оспопрививателем) на месте каждой капли делают четыре пересекающиеся насечки длиной 1–1,5 см в виде «#», следя, чтобы они не кровоточили (допустимо появление крови в виде мелких росинок). Через 5–10 минут место вакцинации протирают сухим ватным диском.

Вероятно, Вы уже задались вопросом, почему вакциной на основе штаммов СТИ и A16R иммунизируют как животных, так и чело-

1 Вспомните случай из Главы 16 (Рис. 16.11), когда семья заразилась от мяса телёнка, иммунизированного этой вакциной. Очевидно, что не только нарушение транспортировки и правил вакцинации привели к инфицированию, но и невыдержанный карантин перед убоем, равно как и убой явно больного животного. Таким образом, этот случай наглядно показывает, как промахи в конкретных звеньях профилактических мероприятий могут в совокупности привести к заражению людей. И это снова пример действия модели швейцарского сыра, которую упоминали в Главе 15. Забыли? Перечитайте!

281

Раздел II • 19. Профилактика

века, а вакциной на основе штамма Sterne – только животных? Дело в том, что в ряде государств введение в организм человека живых микроорганизмов запрещено. Особенно когда имеются альтернативы. Вспомните, пожалуйста, патогенез сибирской язвы и постарайтесь ответить: что ещё может вызывать иммунный ответ?

Вполне вероятно, что внимательные уже обнаружили подсказку, когда речь шла о комбинированной вакцине на основе штамма СТИ и протективного антигена. Конечно, последний, будучи чужеродным белком для иммунизируемого организма, будет вызывать иммунный ответ. Так, ещё в 1904 году, О. Бэйл обнаружил<1>, что отёчная жидкость, возникающая у некоторых животных, болеющих сибирской язвой, содержит некий «агрессин», способный иммунизировать животных, за что и называет его протективным антигеном. Однако природа антигена будет оставаться непонятной для исследователей до 1946 года, когда Г. Гладстон́ докажет<2> его роль в формировании иммунитета. И тут самые внимательные, вспомнив Главу 3, скажут, что Гарри́ Смит3 выделил токсины сибиреязвенного микроба. И действительно, к началу 1950-х годов он получит токсины и установит, что они состоят из соединения летального и отёчного факторов с протективным антигеном (PA + LF/EF), синтез которых, напомним, кодируется плазмидой рХО1. А у какого популярного вакцинного штамма она имеется? Правильно, штамма Sterne. Так, осадив квасцами синтезируемые этим штаммом протективный антиген, летальный и отёчный факторы получили первую неживую сибиреязвенную вакцину – преципитированную вакцину AVP (от англ. Anthrax vaccine precipitated). Дело было в Великобритании, поэтому чуть позже в США получают собственную вакцину из неинкапсулированного штамма V 770-NP1-R( 4 ),

1Bail O. Untersuchungen uber naturliche and kunstliche Milzbrandimmunitat. Zentrabl Bakt Parassiten Infektionskr I rig. 1904; 36:262–272.

2Gladston G. P. Immunity to anthrax: protective antigen present in cell-free culture filtrates. Br J Exp Pathol. 1946; 27(6):394–418.

3Harry Smith, 1921–2011; британский биохимик, бактериолог. Член Королевского общества (1979). Автор работ по механизмам заражения животных сибирской язвой. Участник британской программы по разработке биологического оружия (Портон-Даун).

4Строго говоря, первоначально была получена вакцина на основе другого штамма, однако его токсины содержали преимущественно протективный антиген, поэтому поиск подходящего штамма-продуцента был продолжен. В итоге мутант

282

Мистерии сибирской язвы

«токсины» которого адсорбируют на амфогеле (адъюванте гидроксида аллюминия), ввиду чего препарат называют адсорбированной вакциной AVA (от англ. Anthrax Vaccine Adsorbed; BioThrax®). Как и в случае СССР, первоначально вакцины использовались только для военных нужд, однако уже к 1970 году их постепенно начинают использовать для гражданского применения, и в настоящее время они также рекомендованы Всемирной организацией здравоохранения для иммунизации людей.

Преципитированную вакцину вводят взрослым внутримышечно или подкожно по 0,5 мл. В первом случае ревакцинацию осуществляют на 3-й, 6-й и 32-й неделе, а во втором – на 3-й, 6-й и 9-й неделе, после чего дальнейшую вакцинацию в обоих случаях проводят ежегодно.

Адсорбированную вакцину вводят взрослым по 0,5 мл внутримышечно, ревакцинацию проводят на 30-й день и 6-й месяц. Дальнейшая вакцинация осуществляется через ещё 6 и 12 месяцев (т. е. через год и полтора после первого введения), а затем ежегодно. В случае невозможности внутримышечного введения допустимо вводить подкожно по 0,5 мл, после чего ревакцинацию осуществляют на 14-й день, 30-й день и 6-й месяц. В целях профилактики вводят по 0,5 мл подкожно, после чего осуществляют ревакцинацию на 14- й и 30-й день (в сочетании с антибиотикотерапией).

Как можно видеть из периодов ревакцинации для всех вакцин, формируемый у людей и животных иммунитет не является стойким. Имеются побочные эффекты, включающие головные боли, повышение температуры тела и даже развитие инфекционного процесса, который может закончиться летальным исходом. Поэтому разработки вакцин продолжаются. Живые вакцины предлагается дополнять иными вакцинами(1),<2> для снижения стресса живот-

штамма Vollume (A.Br.Vollume), получивший название V770-NP1-R (A.Br.V770),

обладал необходимыми свойствами.

1 Особенно интересны опыты по клонированию гена pag сибиреязвенного микроба, синтезирующего протективный антиген, в клетки вакцинных штаммов Y. pestis и F. tularensis, позволяющие получить иммунную защиту сразу от двух особо опасных инфекций. Причём поскольку вакцинные штаммы туляремийного микроба индуцируют стойкий иммунный ответ за счёт персистирования внутри клеток орга- низма-хозяина, можно прогнозировать длительный иммунный ответ и на сибирскую язву.

283

Раздел II • 19. Профилактика

ного на фоне уколов, покрывать защитной капсулой для возможности перорального введения животным (капсула защищает споры от действия желудочного сока)<1 >. Предлагаются вакцины на основе инактивированных формалином спор и протективного антигена<2>, вакцины на основе рекомбинантного протективного антигена, например, растительного происхождения<3>, вакцины AVA, дополненные иммуностимулирующим олигодезоксинуклеотидом<4>, связывающимся с TLR-9 для стимулирования иммунного ответа, и даже вакцины на основе плазмидной ДНК B. anthracis, кодирующей протективный антиген и летальный фактор<5>. Последняя оказалась особенно эффективна в опытах по интраназальному заражению кроликов.

Важной проблемой живых вакцин также остаётся неоднород-

ность состава используемой культуры. Так, например, штамм СТИ-

1 диссоциирует на два варианта: первый вариант формирует мелкие

(до 2,5 мм), выпуклые, блестящие колонии с чётким краем и мел-

кими крутыми завитками на поверхности, тогда как второй вариант,

напротив, формирует крупные (3–5 мм), плоские, матовые, шеро-

ховатые колонии с плоским краем и крупными сглаженными за-

витками. Исследования<6> на морских свинках показывают, что пер-

вый вариант обладает значительно большей́ иммуногенностью, а

гетерогенность штаммов объясняется делециями в генах pag и lef

(напомним, ответственных за синтез протективного антигена и ле-

2 RU 2056861 C1, 27.03.1996.

1Benn J. S., Chaki S. P., et al. Protective antibody response following oral vaccination with microencapsulated Bacillus Anthracis Sterne strain 34F2 spores. NPJ Vaccines. 2020; 5:59; DOI: 10.1038/s41541–020–0208–3.

2Brossier F., Levy M., et al. Anthrax spores make an essential contribution to vaccine efficacy. Infect Immun. 2002; 70(2):661–664; DOI: 10.1128/IAI.70.2.661–664.2002.

3Paolino K. M., Regules J. A., er al. Safety and immunogenicity of a plant-derived recombinant protective antigen (rPA)-based vaccine against Bacillus anthracis: A Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 2022; 40(12):1864–1871; DOI: 10.1016/j.vaccine.2022.01.047.

4Shearer J. D., Henning L., et al. Efficacy of the AV7909 anthrax vaccine candidate in guinea pigs and nonhuman primates following two immunizations two weeks apart. Vaccine. 2021; 39(1):1–5; DOI: 10.1016/j.vaccine.2020.10.095.

5Hermanson G., Whitlow V., et al. A cationic lipid-formulated plasmid DNA vaccine confers sustained an- tibody-mediated protection against aerosolized anthrax spores. PNAS. 2004; 101(37):13601–13606; DOI: 10.1073/pnas.0405557101.

6Цыганкова О. И., Фунтикова Т. Н. и др. Изучение некоторых свойств субкультур сибиреязвенного вакцинного штамма СТИ-1 ин витро, в сб.: Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций. Саратов, 1993, 192 с.

284

Мистерии сибирской язвы

тального фактора), возникающими в результате длительного хра-

нения и множественных пересевов. При этом очевидно, что от ва-

риантного состава напрямую зависит эффективность вакцины, по-

этому решением данной проблемы может стать такое изменение штамма, благодаря которому он станет стабильным, в частности,

введение в него дополнительных генетических детерминант<1>. Ис-

следования ведутся, и кто знает, может быть, универсальную вак-

цину, которую так мечтал создать Луи Пастер, подарите миру именно Вы!

В предыдущей главе мы говорили о том, что материал, подозрительный на содержание (контаминацию) сибиреязвенным микробом, подлежит лабораторному исследованию, и, в частности, рассмотрели правила взятия проб почвы. Однако, как вы могли видеть, почва не единственный исследуемый материал. Так, у больных в зависимости от формы заболевания исследуют отделяемое везикулы или карбункула, язвы, фрагменты струпа, кровь, ликвор, мокроту, испражнения. Важно помнить, что забор материала от больных осуществляют до начала антибиотикотерапии! Правильность взятия материала непосредственно влияет на качество лабораторного исследования, позволяя избежать ложноотрицательных результатов. Именно поэтому медицинский персонал осуществляет процедуру отбора под контролем специалиста по особо опасным инфекциям. У животных исследуют кровь, а у трупа, как говорилось ранее, берут ухо или кровь, полученную от надреза уха.

1 Маринин Л. И., Шишкова Н. А. и др. Вариант сибиреязвенного вакцинного штамма СТИ-1 с гемолитической и лецитиназной активностями. Бактериология. 2023; 8(1):23–29; DOI: 10.20953/2500– 1027–2023–1–23–29.

285

Раздел II • 20. Материал

Из объектов окружающей среды отбирают почву, воду, воздух, корма, а также делают смывы. Кратко рассмотрим способы взятия материала.

Содержимое везикулы или карбункула. Аккуратно обрабатывают этиловым спиртом кожу вокруг поражённого места и поверхность везикулы (карбункула). Затем отсасывают содержимое с помощью шприца или пастеровской пипетки и помещают в микроцентрифужные пробирки, содержащие 0,1–0,2 мл транспортной среды, а иголку шприца (кончик пипетки) помещают в пробирку с питательным бульоном. Отделяемое язвы и фрагменты струпа снимают с поверхности стерильным тампоном, смоченным физиологическим раствором (во втором случае допустимо использовать пинцет), и помещают в микроцентрифужные пробирки. В случае проведения ПЦР пробирки должны содержать по 0,1–0,2 мл транспортной среды.

Кровь (человек). Кожу над пунктируемой веной в районе локтевого сгиба тщательно протирают 70%-ным раствором этилового спирта, излишки которого стирают сухой стерильной салфеткой. Отбирают кровь шприцем в количестве 3–5 мл, из которых 0,1–0,2 мл сразу же, непосредственно у постели больного, засевают в питательную среду (агар и бульон Хотти́нгера), а также делают два-три тонких мазка на предметных стёклах. Оставшуюся кровь, избегая образования пены, переносят в пробирку, содержащую 6%-ный раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в отношении 1:20 к объёму крови. Желательно, чтобы посев и мазок осуществлял сотрудник лаборатории (бактериолог, микробиолог), однако это может выполнять и специалист, отбирающий кровь, если он прошёл соответствующий инструктаж.

В случае необходимости, например, при менингите, возможен забор ликвора, который отбирают по 0,5 мл после пункции поясничной или субокципитальной («затылочной») области, а также из мозговых желудочков. Мокроту и испражнения отбирают в стерильную посуду, особенно если имеется присутствие слизи с кровью.

При подозрении на ингаляционное заражение целесообразно взять мазки из носовой полости. Для этого используют стерильный

286

Мистерии сибирской язвы

зонд («тупфер́ »). Принято использовать сухой зонд, однако исследования1 показывают, что предварительно увлажнённый физиологическим раствором зонд более эффективен для извлечения спор. Лёгким движением зонд вводят в носовой проход на несколько сантиметров. Можно предварительно запрокинуть голову пациента таким образом, чтобы зонд входил перпендикулярно относительно тела пациента. Мазок берут разными зондами из обеих ноздрей, после чего помещают рабочие части обоих зондов в пробирку с физиологическим раствором для концентрирования материала. Далее, ряд специалистов рекомендует вынуть их через 10–15 секунд, аккуратно отжимая по стенке во избежание разбрызгивания. Однако имеет смысл аккуратно откусить нерабочую часть зонда таким образом, чтобы имелась возможность закрыть пробирку. также возможно взятие мазка из ротоглотки. В случае проведения ПЦР целесообразно повторить процедуру, поместив рабочую часть зонда в пробирку с 1,5–1,7 мл транспортной среды. Целесообразно также взять мазок из ротоглотки, натощак или через 3–4 часа после еды, для чего голову пациента слегка запрокидывают и фиксируют (во избежание рефлекторных отдёргиваний). Язык прижимают стерильной деревянной палочкой (шпателем) и собирают материал с задней поверхности глотки (не задевая абсцессов, если таковые имеются!). Зонд помещают в пробирку с физиологическим раствором, как и в случае мазка из носоглотки (допустимо опустить зонд в ту же пробирку, куда поместили зонды из носоглотки).

Кровь (животное). С помощью шприца отбирают образец крови из ярёмной или ушной вен (последнее особенно эффективно у коров), а у свиней – из хвостовой.

От трупа животного берут ухо, для чего его (с той стороны, где лежит труп) туго перевязывают лигатурой у основания в двух местах и отрезают между ними. Место отреза прижигают, а с уха, не снимая лигатуры, делают несколько мазков (мазков-отпечатков), после чего аккуратно заворачивают в пергаментную бумагу, смоченную в растворе дезинфектанта. Мазки высушивают на воздухе и помещают в чашки Петри, которые обёртывают плотной бумагой, маркируя надписью «не фиксирован».

1 Rose L., Jensen B., et al. Swab materials and Bacillus anthracis spore recovery from nonporous surfaces. Emerg Infect Dis. 2004; 10(6):1023–1029; DOI: 10.3201/eid1006.030716.

287

Раздел II • 20. Материал

В том случае, если подозрение на сибирскую язву возникло уже после начала патологоанатомического исследования, все манипуляции с трупом прекращают, а на исследование отправляют кровь, кусочки органов (в первую очередь селезёнки, печени и лимфатических узлов), костный мозг (из грудины или бедренной кости). От трупов свиней дополнительно забирают заглоточные лимфатические узлы и участки отёчной соединительной ткани. В случае проведения ПЦР по 0,1–1 г материала дополнительно помещают в пробирки с физиологическим раствором или транспортной средой.

Для исследования заготовленной ранее шерсти производят отбор не менее 5 образцов массой около 2 г из различных мест, отдавая преимущество наиболее загрязнённой шерсти. Если шерсть уже упакована, то отбирают не менее 10 образцов из различных мест каждой упаковки (кипы), а также скопившуюся пыль, если она имеется. От краёв заготовленной кожи отрезают кусочки размером 3 х 3 см (незагнившие и незаплесневевшие). У свежих шкур берут фрагменты с мест кровоподтёков и инфильтратов, если такие имеются.

Пробы незатаренных кормов (зерно, отруби, комбикорм) отбирают из расчёта не менее 5 проб от каждой партии, где на одну пробу приходится не менее 400 г на 4 м, причём отбор осуществляют равномерно по всей глубине. В случае затаренных кормов пробы берут от каждой упаковки партии сухим стерильным щупом, который после каждой партии очищают и фламбируют. От грубых кормов (сено, солома) и зелёной массы из различных мест плотно сложенной массы (скриды) при помощи ножниц и пинцета берут по 40 г на каждые 4 м площади. Корнеплоды отбирают из расчёта 1–3 штуки (в зависимости от размера) на каждые 4 м площади. Все отобранные пробы для каждой категории (в случае кормов – партии) тщательно перемешивают и формируют в среднюю пробу массой не менее 500 г, которую помещают в закрывающиеся полиэтиленовый пакет или стерильную стеклянную банку.

Смывы с объектов окружающей среды делают с мест, наиболее подвергшихся возможной контаминацией возбудителем. Для этого стерильным зондом («тупфером»), предварительно смоченным дистиллированной водой или физиологическим раствором, круго-

288

Мистерии сибирской язвы

выми движениями тщательно протирают поверхность площадью около 100 см2, после чего аккуратно помещают в пробирку с дистиллированной водой или физиологическим раствором. Нерабочую поверхность зонда обрезается.

Забор проб почвы с мест вынужденного убоя скота, стоянок или водопоя животных, мест обнаружения трупов осуществляют на глубину до 15 см. В случае больших участков площадь условно разделяют на квадраты со сторонами не более 4 метров. В каждом квадрате намечают по 5 точек по диагонали на равном расстоянии друг от друга или по 4 точки в углах квадрата и одной посередине (метод конверта). Далее снимают поверхностный слой (2–3 см) и буром, на глубину до 15 см, отбирают не менее 200 г почвы, из которых 100–200 г помещают в мешки из плотной ткани или стерильные стеклянные флаконы, ею закрытые. Не следует для данных целей использовать полиэтиленовые пакеты или плотно закрывающиеся тары, поскольку в таких условиях происходит бурное развитие актиномицетов, губительно действующих на сибиреязвенный микроб. Изъятую, но не отобранную для исследования почву смешивают с сухой хлорной известью (1 часть на 3 части почвы), увлажняют и помещают в углубления (шурф), образовавшиеся в результате отбора проб. Само место отбора дополнительно обрабатывают раствором хлорной извести (10 л на квадратный метр), а используемые инструменты фламбируют.

Внимательные, конечно же, заметили, что отбор проб почвы осуществляется тем же способом, как и в случае скотомогильников. Ну а самые внимательные заметили, в чём отличие? Правильно, в случае скотомогильника отбирают почву на глубину до 2 м, тогда как в данном случае – только до 15 см.

Пробы воды берут у поверхности (на глубине около 10 см) и у дна при помощи батометра или иными средствами в объёме от 0,5 до 1 л, и помещают в стерильные стеклянные банки, закрывающиеся стерильными резиновыми пробками (использование завинчивающихся крышек не рекомендуется ввиду возможности подтекания пробы по резьбе во время снятия). Также у береговой линии отбирают не менее 200 г придонного осадка, из которого 100–200 г помещают в мешки из плотной ткани или флаконы, ею закрытые.

289