2.Гидродинамические методы
•В случае водорастворимых белков обычно измеряют скорость седиментации с помощью аналитического ультрацентрифугирования или центрифугирования в градиенте плотности сахарозы
•Коэффициент седиментации для водорастворимого белка равен:
S0=M(1-Vρ)/(N6πηRc),
Где M- молекулярная масса белка,
V- его парциальный удельный объем (величина, обратная плотности), η – вязкость раствора (~ 1 сантипуаз), ρ – плотность раствора (~ 1 г/мл),
Rc- радиус Стокса (размер "эквивалентной гидродинамической сферы").
ρ и η известны, Rc можно определить с помощью гель-фильтрации, остаются только две неизвестные величины – V и M.
Для водорастворимых белков V можно вычислить, исходя из аминокислотного состава или непосредственно измерить, либо просто принять равным 0,72-0,75 мл/г
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
• Таким образом, определив S0, можно найти M
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
МИТХТ |
2. Гидродинамические методы |
||
|
|||
|
|
|
|
В ситуации с мембранным белком возникают дополнительные проблемы, поскольку гидродинамическая частица – это белково-детергентный комплекс, поэтому М и V в данном случае являются молекулярной массой и удельным объемом комплекса (Мк и Vк).
Vк нельзя оценить, не зная состава комплекса. В этом случае для нахождения молекулярной массы белка используют два метода:
• 1) Прямо измеряют количество связанного детергента на 1 г белка (спектральные методы, радиоактивно меченный детергент, для выделения комплексов применяют различные методы, например, гель-фильтрацию).
Установив относительное содержание белка и детергента в комплексе, значение Vк получают как средневзвешенное соответствующих величин для чистого белка и чистого детергента. После этого находят Мк, а поскольку соотношение между белком и детергентом в комплексе известно, находят молекулярную массу белка.
• 2) Измеряют S0 в средах с разными значениями плотности раствора ρ. Такие среды обычно получают, использую смеси H2O и D2O. Из графика зависимости S0 от ρ находят как Мк, так и Vк. При этом предполагается, что Vк – это средневзвешенное соответствующих величин для чистого белка и чистого детергента:
Vк = (Доля белка) *V белок + (Доля детергента)*V детергент,
Оценив Vбелок и взяв Vдетергент из соответствующих таблиц, получают молекулярную
массу белковой составляющей Mк.
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor.
Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
МИТХТ |
Липидно-белковые взаимодействия |
||
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
Для установления взаимосвязи липидно-белковых взаимодействий со структурой и функциями мембран необходимо ответить на такие вопросы:
1.Как периферические мембранные белки, связанные с поверхностью бислоя, взаимодействуют с липидами?
2.Насколько прочно связаны внутримембранные белки с липидами?
3.Какова природа липидного бислоя, прилегающего к белку, влияют ли липиды на структуру и функции внутримембранных белков?
4.Каково влияние мембранных белков на укладку и динамические
свойства мембранных липидов?
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
ЗАНЯТИЕ 9
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Белки биологических мембран
•Липидно-белковые взаимодействия
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Универсальная жидкостно-мозаичная модель
биологической мембраны (1972)
-Самоассоциация
-Возможность передвижения компонентов
Взаимодействия:
1. Липид-липидные;
2. Липидно-белковые;
3. Белок-белковые.
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Липид-белковые взаимодействия
Для установления взаимосвязи липид-белковых взаимодействий со структурой и функциями мембран необходимо ответить на такие вопросы как:
1.Как периферические мембранные белки, связанные с поверхностью бислоя, взаимодействуют с липидами?
2.Насколько прочно связаны внутримембранные белки с липидами?
3.Какова природа липидного бислоя, прилегающего к белку, влияют ли липиды на структуру и функции внутримембранных белков?
4.Каково влияние мембранных белков на укладку и динамические
свойства мембранных липидов?
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Задачи: выяснить, есть ли у белков участки, специфически взаимодействующие с определенными липидами; можно ли считать белково–липидные комплексы долгоживущими (около 10^-3 с).
Методы: спектроскопия ИК , спектрометрия ЯМР, ЭПР и флуоресценция.
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
1. Взаимодействие периферических мембранных белков с липидами
Поверхностные и периферические белки связываются с бислоем за счет электростатического взаимодействия.
Методом ДСК показано, что на фазовый переход липидов гель-жидкий кристалл они не влияют.
Исследование взаимодействия цитохрома С с модельными липидными мембранами методом 31PЯМР
Спектр водной дисперсии тион-ФХ/КЛ а - в отсутствии цитохрома с б - в присутствии цитохрома с
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor.
Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной1 - сигнал,знак. соответствующий тион-ФХ
2 - сигнал, соответствующий КЛ
Солюбилизация и реконструкция мембранных
белков
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
2. Связывание липидов с внутримембранными белками
Действие цитохромоксидазы на липидный бислой (пример)
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
ЭПР - спектры спин-меченных липидов, включенных в мембранные препараты цитохромоксидазы.
Содержание фосфолипидов, мг на 1 мг белка:
1 – 0,1 (0);
2 – 0,24 (10);
3 – 0,33 (40);
4 – 0,49 (60)
В скобках – процентное содержание липидов в «жидком» бислое.
3. Природа липидного слоя, прилегающего к белку
3.1 Цитохром с – оксидаза митохондрии
Цитохром с–оксидаза митохондрии -
протонный редокс–насос, катализирующий окисление цитохрома с и восстановленеие кислорода до воды.
Фермент связывает от 40 до 55 молекул липидов.
Кардиолипин – основной фосфолипид, связанный ферментом.
Предполагается, что КЛ необходим для обеспечения каталитической активности фермента.
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Модель димера митохондриальной цитохром с–оксидазы , построенная с использованием метода реконструкции изображения
3.2 Na+/ K+ -АТФ-аза
Na+/K+ - АТФ-аза катализирует АТФзависимый транспорт ионов Na+ и K+ через плазматическую мембрану животных.
Na+/K+ -АТФ-аза связывается с 60 фосфолипидными молекулами, отдавая предпочтение отрицательно заряженным липидам.
КЛ>ФС>ФК>ФГ=ФЭ
Для реконструкции Na+/K+ -АТФ-азы важна структура полярных головок и вязкость бислоя.
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
3.3 Са2+ - АТФ-аза
Са2+ - АТФ-аза – фермент, осуществляющий активный транспорт Са2+ внутрь саркоплазматического ретикулума, уменьшая концентрацию ионов в цитоплазме во время релаксации мышцы.
Белок имеет 10 трансмембранных спиральных участков. На его активность влияют структура липида и физическое состояние бислоя.
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Са2+ - АТФ-аза
Зависимость активности Са2+ - АТФ-азы СПР от содержания фосфолипидов
Для полной активации фермента на одну молекулу АТФ-азы должно приходиться 30 молекул ФЛ. Считают, что этого количества достаточно, чтобы вокруг каждой молекулы белка образовался фосфолипидный слой.
Была предложена концепция пограничных или аннулярных липидов, т.е. липидов, непосредственно граничащих с белком. Критическим фактором,
Этот документопределяющимбыл отредактирован с IcecreamферментативнуюPDF Editor. активность, по этой концепции является
Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
липидный состав аннулярного слоя.
3.4 ß-гидроксибутиратдегидрогеназа (БДГ) –
фермент, находящийся на внутренней поверхности внутренней митохондриальной мембраны, катализирует окисление ß- гидроксибутирата с помощью NAD.
БДГ – тетрамер, молекулярная масса 1 субъединицы равна 31 Кда.
В липосомы, состоящие из липидов ДОФХ и пиренил-ФХ (1:1), добавляли БДГ и определяли тушение флуоресценции триптофана и скорость ферментативной реакции от содержания ФХ.
Вывод: активировать БДГ способен только ФХ, который связывается
Этотсдокумент12 центрамибыл отредактированвс IcecreamмолекулеPDF Editor. фермента Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
3.5 Родопсин
Родопсин – зрительный пигмент, содержащийся в палочках сетчатки. Под действием света он претерпевает светозависимые коформационные изменения, инициируя целый каскад событий, конечным результатом которых является зрительный сигнал.
Определено, что одна молекула родопсина связывается с 24 липидными
молекулами, отдавая небольшое предпочтение кардиолипину перед
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. АктивируйтефосфатидилхолиномPRO версию, чтобы убрать водяной знак.
4. Влияние мембранных белков на структуру и динамические свойства мембранных липидов
Методы исследования:
ИК-спектроскопия, ЯМР–спектрометрия, ДСК , флуориметрия
ИК-спектроскопия с Фурье-преобразованием
используется для определения конфигурации ацильных цепей.
Данные, полученные этим методом, свидетельствуют о незначительном изменении упорядоченности ацильных цепей (транс/гош –конфигурации) в присутствии белков.
Результаты согласуются с данными 2Н-ЯМР.
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Дифференциальная сканирующая калориметрия
используется для изучения влияния мембранных белков на температуру фазового перехода липидов
Термограмма ДПФХ с бактериородопсином, указано соотношение липид/белок
В присутствии интегральных белков наблюдается: А) незначительное уменьшение температуры фазового перехода; Б) увеличение ширины интервала перехода;
В) уменьшение энтальпии перехода
Определено, что энтальпия перехода чаще всего уменьшается линейно с увеличением содержания белка. Это позволяет найти число липидных молекул, связанных с одной молекулой белка: 155 молекул липида - на 1 молекулу бактериородопсина ;
685 молекул липида – на 1 молекулу белка полосы 3
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Влияние белков на полиморфизм фосфолипидов
Белки оказывают сильное влияние на полиморфизм ФЛ:
- Гидрофобный полипептид грамицидин А при соотношении липид/белок (10:1) приводит ДОФХ к переходу из L в Hll фазу. При этом происходит агрегация грамицидина А, дегидратация липидов, которая стабилизирует гексагональную фазу
- Гликофорин стабилизирует бислойную конфигурацию небислойного липида
ДОФЭ
-ЭтотНадокументполиморфизмбыл отредактирован сКЛIcecreamвлияютPDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
положительно заряженные белки
Белок–липидные взаимодействия
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Изменения в структуре липидного бислоя:
А – локальное возрастание
упорядоченности части липидной массы (создание аннулярного слоя липидов). Бактериородопсин, цитохромоксидаза и др.
Б – эластичная деформация одной стороны бислоя.
Периферические белки, не проникающие на всю глубину бислоя (цитохром С )
В – резкое изменение кривизны и деформация бислоя.
Гидрофобные белки. Цитохром b5.
Г – изменение геометрии бислоя – сжимание одних частей и уширение других.
Трансмембранные белки (гликофорин мембран эритроцитов).
Выводы:
1.Общим для всех интегральных белков является формирование иммобилизованного «липидного кольца», контактирующего с гидрофобной частью молекулы белка
2.Влияние белков, как правило, ограничивается только пределами этих колец и не распространяется на остальную часть бислоя
3.Состав липидов в ближайшем окружении молекул белка зависит от заряда его гидрофильной части
4.Белок-липидное взаимодействие может быть причиной латерального фазового разделения в липидном бислое
5.Неполярное окружение липидов способствует агрегации -
спиральных участков гидрофобных фрагментов белковой молекулы и их ориентации перпендикулярно поверхности мембраны
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
ЗАНЯТИЕ 10
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Свойства мембран
•«Текучесть» или микровязкость мембран
•Латеральная диффузия липидов и белков в мембранах
•Асимметрия мембран
•Электрические свойства мембран
•Проницаемость биомембран
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Свойства мембран
1.«Текучесть» или микровязкость мембран – сопротивление, которое мембрана оказывает различным типам перемещений в ней.
Методы определения: ЭПР и флуоресценция (наблюдение за движением спиновых или флуоресцентных зондов, включенных в мембрану).
Спектроскопические параметры низкомолекулярных зондов, используемые для оценки текучести или микровязкости:
-Время вращательной корреляции;
-Параметр упорядоченности;
-Поляризация флуоресцентных зондов;
-Коэффициент распределения зондов между мембранной и водной фазой.
«Текучесть» мембраны уменьшается, если на нее оказываются воздействия , приводящие к уменьшению площади, приходящейся на одну липидную молекулу:
|
понижение температуры; |
•Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. |
|
• |
увеличение гидростатического давления; |
Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак. |
|
• |
добавление холестерина к фосфолипидам. |
Физиологическое значение текучести мембран
1. Термический стресс (тепловая адаптация E. coli)
Выращивание E. coli в условиях низких температур приводит к изменению жирнокислотного состава в сторону большего содержания ненасыщенных кислот и поддержания мембран в текучем состоянии.
2.Адаптация к повышению давления
Барофильная NPT3 морская бактерия при изменении давления увеличивает содержание ненасыщенных жирных кислот в мембранах и благодаря этому находится в жидкокристаллическом состоянии.
3. Развитие и трансформация клеток сопровождается изменением состава липидов и следовательно текучести мембран.
В растущих и делящихся клетках мембраны более «жидкие».
Обнаружено, что вязкость плазматических мембран нормальных клеток печени и гепатомы (раковых клеток) различаются.
В клетках гепатомы снижается содержание сфингомиелина и холестерина,
Этот документчтобылприводитотредактированкс IcecreamуменьшениюPDF Editor. микровязкости мембран раковых клеток
Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
2. Латеральная диффузия липидов и белков в мембранах
Перемещение липидов и белков в пределах бислоя характеризуется
коэффициентом латеральной диффузии.
Для измерения коэффициента латеральной диффузии используют различные методы.
Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP)
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Суть метода:
1.На мембране, имеющей равномерно распределенную флуоресцентную метку, лазером обесцвечивают пятно диаметром 1 мкм;
2.Исследуют кинетику разгорания флуоресценции этого участка и по скорости восстановления флуоресценции оценивают скорость латеральной диффузии
Коэффициенты латеральной диффузии некоторых мембранных липидов и белков
Объект исследования |
D транс 1*10*-8 |
Подвижность ,% |
|
|
|
1. Фосфолипидные везикулы |
|
|
NBD-ФЭ |
1-5 |
100 |
|
|
|
NBDграмицидин |
2 |
100 |
Гликофорин |
2 |
100 |
|
|
|
Родопсин |
1-3 |
100 |
|
|
|
Ацетилхолиновый рецептор |
1-2 |
100 |
|
|
|
Белок полосы lll |
1-2 |
100 |
|
|
|
2. Природные биомембраны |
|
|
|
|
|
Липидные метки |
0,2 - 2 |
100 |
|
|
|
Родопсин (диски палочек сетчатки) |
0,4 |
100 |
Ацетилхолиновый рецептор |
0,0003 |
- |
(миобласты) |
|
|
Белок полосы lll (тени эритроцитов) |
0,004 |
10 |
|
|
|
3. Мембраны ,у которых нарушена связь с цитоскелетом |
||
|
|
|
Белок полосы lll (эритроцит, |
0,2 |
100 |
дефицитный по спектрину) |
|
|
Коэффициент диффузии D=10-12cм2/с – отсутствие движения;
D=10-8 cм2/с – движение, характерное для липидов в биомембранах,
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor.
АктивируйтесоответствующееPRO версию, чтобы убрать водянойперемещениюзнак. на расстояние около 2 мкм за 1 сек.
Ограничение латеральной диффузии мембранных белков
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Способы ограничения латеральной подвижности белков плазматической мембраны:
А – белки могут ассоциировать в большие комплексы (молекулы бактериородопсина в пурпурной мембране Halobacterium).
Б – специализированные белки мембраны одной клетки связываются с белками мембраны другой клетки, образуя специализированный клеточный контакт (эпителиальные клетки).
В – белки мембраны взаимодействуют с белковыми комплексами цитоплазмы (спектрин взаимодействует с белком полосы lll через анкирин)
Липидные микродомены в мембране
Липидные рафты в плазматической мембране (по данным атомно-силовой микроскопии)
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Существование доменов в тонких пленках из смесей липидов, содержащих ФХ, СМ и Сhol
(по данным флуоресцентной микроскопии)
3. Асимметрия мембран
Методы изучения асимметрии мембран:
1.Энзиматическая модификация;
2.Химическая модификация;
3.Иммунологические методы;
4.Модификация в результате переноса молекул;
5.Физико-химические методы
Требования к изучению асимметрии мембран: -асимметрия не должна меняться в ходе эксперимента;
-выбранная модель должна быть адекватна выбранной мембране
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
3.1. Топография мембранных белков
зависит от способа, каким данный белок был внедрен в мембрану после биосинтеза
Для определения топографии белка используют несколько методов, таких как:
3.1.1. Протеолиз, который заключается в следующем:
- получают ориентированный мембранный препарат, содержащий изучаемый белок;
-обрабатывают протеолитическими ферментами (трипсином, папаином)
-по местам расщепления устанавливают участки белка, находящиеся на наружной стороне мембраны
Сложности метода:
А) необходимо быстро ингибировать используемые протеазы; Б) необходимо убедиться, что мембрана не претерпевает повреждений,
которые могут приводить к гидролизу участка белка, располагающегося на внутренней стороне мембраны; В) необходимо помнить, что отсутствие расщепления может быть из-за
Этот документособенностейбыл отредактировантретичнойс Icecream PDF Editorструктуры. мембранного белка, что делает участки
Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
белка недоступными для фермента
Топография бактериородопсина в мембране
Бактериородопсин в пурпурной мембране обладает жесткой упаковкой и участки, расположенные внутри мембраны, будут недоступны для макромолекул ферментов.
ПриЭтот документобработкебыл отредактированпурпурныхс Icecream PDF Editorмембран. протеиназой (папаином) было обнаружено
Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
четыре участка полипептидной цепи, выступающих на поверхность по обе стороны липидного бислоя.
3.1.2. Иммунологические методы
заключаются в использовании специфических антител, которые связываются с белками в ориентированных мембранных препаратах. Места связывания определяют электронной микроскопией, пометив антитела коллоидным золотом.
Используют:
Моноклональные антитела , которые высокоспецифичны к определенным местам связывания на полипептиде (эпитопам).
Наиболее удобны антитела, которые связываются с белком как в мембране, так и с денатурированным фрагментом белка (после разделения с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН).
Поликлональные антитела против синтетических пептидов, соответствующих отдельным белковым фрагментам, позволяют точно выяснить, доступна ли эта область белка для связывания антитела
Недостатки метода: антипептидные антитела могут не связываться с
нативным белком, так как потенциальный центр связывания может
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor.
АктивируйтенаходитьсяPRO версию, чтобыв такойубрать водянойконформации,знак. что не будет узнан антителом.
3.1.3. Химическая модификация белка
проводится в ориентированных мембранах, при этом белок вступает во взаимодействие с реагентом, который действует лишь на одной стороне мембраны или в ее гидрофобной области
Реагенты, применяемые для изучения топографии мембранных белков
1. Определение групп белка, находящихся на поверхности
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
2. Определение групп белка, погруженных в мембрану
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Недостатки химической модификации белков
1.Реагент модифицирует белок не только в том реакционном месте, для которого предназначен;
2.Химическая модификация может привести к повреждению мембраны и сделать ее проницаемой для реагента
3.1.4.Локализация специфических центров
-Углеводные остатки в гликопротеинах находятся на наружной поверхности плазматической мембраны. Определяя места их присоединения, получают информацию о расположении исследуемого белка.
- Определяя сайт фосфорилирования при ферментативной модификации белка и зная локализацию фермента, определяют топографию белка.
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
3.1.5. Генетические подходы определения топографии белка
Генетическая модификация мембранных белков позволяет определять их местоположение.
Пример: ОmpA - белок наружной мембраны E. coli. -Методами генной инженерии в белок ОmpA встроили короткие пептиды в определенные места; -Провели протеолиз модифицированного белка, встроенного в мембрану;
-Определили, экспонированы ли участки, содержащие включенный пептид, на поверхности клеток.
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Топография родопсина в мембране (пример)
Использовали ограниченный протеолиз белка в составе нативной мембраны, моноклональные антитела, химическую модификацию проникающими и непроникающими реагентами, гликозилирование и фосфорилирование. Показали, что мембранную часть молекулы родопсина составляют 7 сегментов полипептидной цепи, находящихся в α-спиральной конформации и пронизывающихЭтот документ был отредактировантолщус Icecream PDFфоторецепторнойEditor. мембраны. В водное пространство экспонированыАктивируйте PRO версию, чтобыNубрать– иводянойС- знакконцевые. участки и петли , соединяющие мембранные сегменты.
Липидная асимметрия в фосфолипидных везикулах
Для ММВ, состоящих из смеси двух и более липидов, характерно их асимметричное распределение. Оно определяется различием объемов молекул ФЛ и большой кривизной поверхности ММВ.
•Размер полярных групп,
•заряд полярных групп,
•длина и степень ненасыщенности углеводородных цепей определяет нахождение липидов во внутреннем или наружном слое липосомы.
Например:
если состав смеси ФХ, СМ, ФГ, ФЭ,ФИ и ФК, то ФХ, СМ, ФГ находятся в наружном слое,
ФЭ,Этот документФИ,былФКотредактирован– во внутреннемс Icecream PDF Editor. слое ММВ. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
S- площадь 1-ой молекулы на границе мембрана-вода; I-расстояние между полярными головками
V- объем, эанимаемый липидными хвостами
Флип-флоп –
трансбислойное движение липидов
Скорость движения флип-флоп зависит от природы липидов, температуры и равновесности их распределения между монослоями.
Пример: При 30оС в везикулах из ДОФХ переход происходит очень медленно и через 32 часа только 6% введенного (С-13^CH3)-ДОФХ было обнаружено во внутреннем монослое (равновесное содержание 37%)
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
3.2 Трансмембранная асимметрия липидов
Биосинтез липидов и сборка мембраны протекают асимметрично. Для установления липидной асимметрии применяют набор методов, таких как:
3.2.1. Химическая модификация фосфолипидов
Модифицируют ФЭ и ФС реагентом ТНБС, который не проникает через бислой, а ковалентно связывается с аминогруппами тех ФЛ, которые находятся на наружной стороне мембраны.
Доля ФЭ, вступившего в реакцию, должна служить мерой его содержания на наружной поверхности мембраны.
Артефакты:
реакция может не доходить до конца; ФЭ может перемещаться с внутренней стороны на наружную.
Синтезируют аналоги ФЛ с реакционноспособными сульфгидрильными группами, включают их в исследуемые мембраны. Мембраны обрабатывают непроникающим реагентом, избирательно реагирующим по этим группам.
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
3.2.2. Модификация мембраны в результате переноса фосфолипидов
Спонтанный обмен ФЛ между мембранами протекает с очень малой скоростью.
Выделены белки, катализирующие перенос липидов –
липидпереносящие белки (ЛПБ).
Существуют ЛПБ, которые обладают абсолютной специфичностью к
ФХ, ФИ, ФС, СМ.
Эксперимент : мембранные образцы инкубируют с избытком липосом, содержащих радиоактивно меченный ФЛ, в присутствии ЛПБ.
Степень переноса оценивают, измеряя удельную радиоактивность в липосомах и мембранах.
Результат:
-если ФЛ в мембране полностью доступен для обмена, то его радиоактивность в липосомах и мембранах в конце эксперимента будет одинаковой; -если изучаемый липид находится на внутренней стороне мембраны, то т.к. он
недоступен для обмена, его удельная радиоактивность в мембране будет ниже,
чемЭтот документв липосомахбыл отредактирован. с Icecream PDF Editor.
Активируйте PROДостоинство:версию, чтобы убрать водянойЛПБзнак. не проникает через мембрану
Недостатки: равновесие устанавливается медленно, за несколько часов.
3.2.3. Энзиматическая модификация мембранных липидов
а) Фосфолипидов
Фосфолипазы А2, С, D, сфингомиелиназа не проникают через мембрану и действуют только на ее наружную сторону.
Сложности метода:
Необходимо тщательно контролировать ход реакции.
1.При гидролизе фосфолипазой А2 образующиеся лизо-ФЛ, могут дестабилизировать бислой и увеличивать скорость трансмембранной миграции.
Этот2.документФерментыбыл отредактированс разнойс Icecream PDFскоростьюEditor. гидролизуют ФЛ. Например, фосфолипаза
Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
А2 медленно расщепляет кислые ФЛ, а ФХ и ФЭ – быстро.
Энзиматическая модификация мембранных липидов
Гликолипиды окисляют галактозооксидазой или периодатом натрия с последующим восстановлением 3^Н-боргидридом натрия и анализом образующегося продукта.
Холестерин окисляют холестериноксидазой.
3.2.4. Иммунохимические методы анализа
Кардиолипин (КЛ) – фосфолипид, обладающий иммунной активностью. По образующемуся комплексу КЛ - иммуноглобулин можно судить о наличии КЛ в наружном монослое.
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
3.2.5. Физико-химические методы анализа Дифференциация наружной и внутренней сторон бислоя методом ЯМР
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
3.2.5. Физико-химические методы анализа
1Н-ЯМР со сдвиговыми реагентами Pr3+ или Eu3+ (пример).
Наблюдая за смещением сигнала от наружных молекул ФХ и измеряя площади сдвинутого и несдвинутого пика, определяют соотношение числа молекул в наружном и внутреннем монослоях, образующих бислойную везикулу.
31
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor.
Активируйте PRO версию, чтобыРубрать- ЯМРводянойсзнакуширяющими. ионами Mn2+, Со2+ или Gd3+
Липидная асимметрия в эритроцитах человека
Распределение липидов в мембране эритроцитов четко показано и очень асимметрично
ФЛ сумма (нар.+ внутр.)
СМ - 27% (22% + 5%) ФХ - 29% (22% + 7%) ФЭ - 30% (6% + 22%) ФС - 14% (0% + 14%)
Считают, что асимметрия липидов поддерживается связыванием
Этотцитоскелетныхдокумент был отредактированбелковс Icecream PDFсEditorаминофосфолипидами. внутренней поверхности
Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Определение скорости флип-флоп – переходов фосфолипидов в мембране эритроцита
Радиоактивные липиды из липосомы включают в наружный слой мембраны эритроцитов с помощью ЛПБ.
Клетки инкубируют для перехода меченых липидов во внутренний слой. Препараты обрабатывают фосфолипазой А2 и определяют, какая часть ФЛ стала недоступна для фосфолипазы.
Скорость флип-флоп для ФЛ изменяется в ряду следующим образом: ФС > ФЭ >ФХ >СМ. Липиды, которые характерны для наружной стороны мембраны, мигрируют медленнее. Быстрая трансмембранная миграция амино-
ЭтотФЛдокумент–былАТФотредактирован-зависимыйс Icecream PDFпроцессEditor. . Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Предположили, что специфичный флип-флоп липидов катализируется ферментами АТФ-зависимыми транслоказами
Выводы об асимметрии мембран:
1.Для большинства биологических мембран характерна трансмембранная асимметрия
2.У белков асимметрия абсолютная
3.Интегральные белки встроены в мембрану таким образом, что к цитоплазматической и наружной поверхностям обращены разные белковые домены
4.Существует и липидная асимметрия, которая создается и поддерживается АТФ-зависимыми транслоказами или взаимодействием липидов с цитоскелетом или внеклеточным матриксом на поверхности мембран
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
4. Электрические свойства мембран
Полный электростатический потенциал липидного бислоя
ΨS - поверхностный потенциал ΔΨ – трансмембранный потенциал
ΨD - внутренний дипольный потенциал
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Полный электростатический потенциал липидного бислоя
1.Поверхностный потенциал ΨS - разность потенциалов между
водной фазой и поверхностью мембраны. Поверхность2 мембраны имеет “–” заряд (связывание с белками, Са)+ .
2.Трансмембранный потенциал ΔΨ - разность электрических потенциалов между двумя водными фазами, разделенными мембраной. Величина ΔΨ определяется разницей концентрацией катионов и анионов в водных фазах по разные стороны липидного бислоя.
3.Потенциал внутренних диполей ΨD - разность потенциалов между поверхностью мембраны и ее углеводородной областью, возникает за счет ориентации электрических диполей у поверхности бислоя.
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Измерение трансмембранного потенциала ΔΨ
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Потенциал внутренних диполей ΨD
Какое значение имеет дипольный потенциал внутри липидного бислоя (положительное или отрицательное)?
•Вклад диполей различных групп:
|
дипольный момент фосфохолиновой группы - |
|
(-), 18-25 D (3-9 D) |
|
дипольный момент групп С=О сложноэфирных связей - |
|
(+), 1,83 D |
|
дипольный момент мембраносвязанной воды - |
|
(+), 1,83 D |
• |
Изучение транспорта гидрофобных ионов через мембрану: |
|
|
сравнивали скорость прохождения через бислой |
|
|
тетрафенилфосфония |
+ Р(С6Н5)4 |
|
тетрафенилбората |
– В(С6Н5)4 |
Было доказано, что транспорт гидрофобных катионов через мембраны затруднен по сравнению с гидрофобными анионами -
дипольный потенциал внутри липидного бислоя имеет положительное значение.
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
5. Проницаемость биомембран
Обеспечение избирательной проницаемости для веществ, транспортируемых в процессе жизнедеятельности клетки в среду и из среды в клетку – одна из наиболее существенных функций
Способностьмембранмолекулы. растворенного низкомолекулярного вещества проникать через мембрану количественно выражается коэффициентом
проницаемости.
Чтобы пересечь бислой, молекула должна:
1)Проникнуть в мембрану, преодолев поверхностное натяжение или барьер свободной энергии на границе мембраны,
2)Продифундировать через бислой,
3)Выйти из мембраны с
противоположной стороны, вновь преодолев энергетический барьер на границе раздела фаз.
Р= КрDм/d [см/с] , где P- коэффициент проницаемости , Кр – коэффициент распределения, Dм – коэффициент диффузии, d – толщина мембраны
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Коэффициенты распределения веществ и их проницаемость
через мембраны
Кр=См/Св, где Смконцентрация вещества в мембране, Св – концентрация веществ в водной фазе.
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
|
5.1 Проницаемость для воды |
|
|
Вода легко проникает через липидный бислой. |
|
|
Транспорт воды изучают используя ОЛВ: |
- ---- |
|
получают ОЛВ с высокой концентрацией соли |
|
|
внутри; |
|
|
-помещают в среду, содержащую меньшую |
|
|
концентрацию соли снаружи; |
|
|
-наблюдают за размером ОЛВ. |
|
|
Везикулы набухают. Увеличение радиуса может |
|
|
достигать 5% . |
|
Проницаемость биомембран для воды в 10 раз больше, чем |
|
|
проницаемость модельных мембран. |
|
|
На примере эритроцитов и мембран почек показано, что в |
|
|
биомембранах имеются каналы для воды. |
|
|
Эксперимент: мембраны эритроцитов обрабатывали |
|
|
сульфгидрильным реагентом (п-хлормеркурийбензо- |
|
|
сульфонатом), проницаемость для воды уменьшалась до уровня |
||
модельного бислоя.
Предполагают, что этот реагент действует на белок полосы 3 или полосы 4, которые являются анионными каналами и участвуют в транспорте молекул воды.
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
5.2. Проницаемость липидных бислойных мембран для ионов
Проницаемость для протонов - от 10*-4 до 10*-8 см/с. Модели существования специального механизма протонной проницаемости:
-Мембрану пересекают цепочки из молекул воды, соединенные водородными связями, по этим цепочкам эстафетным механизмом осуществляется перенос протонов (экспериментальных данных нет)
-Свободные жирные кислоты, присутствующие в мембране в минорных количествах выступают в роли переносчиков протонов (экспериментально подтверждено)
Проницаемость для ионов (Cl-, Na+, K+) – от 10*-10 до 10*-14 см/с.
Механизм их переноса связывают с :
-Фазовым состоянием липидов;
-Латеральным разделением фаз;
-Зарядом полярных головок ФЛ (ФХ);
-Дефектами в мембране, вызванными действием ферментов (липаз) или перекисным окислением липидов
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Вязкость мембранных липидов клеток Е. соli , выращенных при различных температурах
Температура, оС |
Липиды, экстрагированные из |
Мембраны |
||||
|
мембран |
|||||
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
роста |
измерени |
, нс |
|
, П |
, нс |
, П |
я |
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
15 |
15 |
2,8 |
|
1,8 |
- |
- |
23 |
23 |
- |
|
- |
3,5 |
2,5 |
23 |
37 |
- |
|
- |
1,6 |
1 |
30 |
30 |
2,7 |
|
1,9 |
- |
- |
37 |
37 |
2,6 |
|
1,8 |
3,3 |
2,5 |
43 |
43 |
2,7 |
|
1,9 |
- |
- |
43 |
15 |
13,8 |
|
15 |
- |
- |
где - вязкость среды, r – эффективный радиус спин-метки,
k – постоянная
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor.
Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.Больцмана, Т – абсолютная температура.
ЗАНЯТИЕ 11
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Транспорт через мембрану
Пассивный транспорт :
•простая диффузия
•облегченная диффузия
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Избирательный транспорт через мембрану
•Пассивный транспорт веществ по их градиенту концентраций без затрат энергии извне
•Активный транспорт против градиента концентрации вещества, требующий специальных источников энергии
•Транспорт макромолекул и клеточных частиц (эндоцитоз и экзоцитоз)
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Избирательный транспорт через мембрану
Липидный бислой
Белковый |
Транспортируемая |
Белок- |
|
канал |
молекула |
|
|
|
|
переносчик |
|
Электрохимический
градиент
Э |
н |
е |
р |
г |
и |
я |
Пассивный
• Малые молекулы транспорт
- простая диффузия
- облегченная диффузия
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте- активныйPRO версию, чтобытранспортубрать водяной знак.
Активный
транспорт
•Крупные молекулы (белки, НК)
-эндоцитоз и экзоцитоз
Виды транспорта через мембрану
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Пассивный транспорт через мембрану
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Простая диффузия
•Примером простой диффузии служит явление осмоса.
•Суть этого процесса состоит в следующем: если два водных раствора разделены мембраной, которая пропускает лишь молекулы Н2О, но непроницаема для растворенного вещества, то молекулы Н2О будут самопроизвольно диффундировать в более концентрированный раствор.
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Пассивный транспорт через мембраны
Простая диффузия
•Простая диффузия - перенос вещества через мембрану из области с большей его концентрацией в область с меньшей концентрацией
•Для незаряженных молекул процесс описывается законом простой диффузии
(закон Фика): количество вещества (I), переносимого в единицу времени через единицу площади поверхности, прямо пропорционально градиенту концентрации растворенного вещества внутри мембраны:
I = - Ddc/dx,
где I - поток переносимого вещества;
D - коэффициент диффузии, м /с (характеристика липидного
бислоя и транспортируемой молекулы);
с - концентрация вещества;
2
х- толщина мембраны.
•Для заряженных молекул процесс описывается уравнением Нернста-
Планка:
I = - Ddc/dx + Аdc/dx - учитывается влияние электрического поля на транспорт ионов.
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Простая диффузия
Незаряженные молекулы |
Заряженные частицы |
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Искусственный липидный бислой
Облегченная диффузия
•Клеточные мембраны проницаемы и для различных ионов и полярных молекул, таких как сахара, аминокислоты, нуклеотиды и многие другие метаболиты, которые проходят через искусственные бислои чрезвычайно медленно
•Облегченная диффузия включает два пути переноса веществ и ионов через мембраны:
1) с помощью "переносчиков" |
2) с помощью мембранных каналов |
Канал 
Переносчик 
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Облегченная диффузия с помощью переносчиков
•Переносчики - специфические молекулы или их ансамбли, которые связывают транспортируемый агент на одной стороне мембраны и в виде комплекса переносят его через гидрофобную зону бислоя
•После диссоциации комплекса на противоположной стороне мембраны переносимое вещество оказывается в водной фазе, а переносчик возвращается в исходное положение
Процесс переноса состоит из нескольких стадий:
|
образование комплекса |
Переносчик |
|
движение комплекса |
|
|
диссоциация комплекса |
|
|
движение свободного переносчика |
|
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Облегченная диффузия с помощью переносчиков
•Облегченная диффузия с помощью переносчиков напоминают реакцию между ферментом и субстратом без образования ковалентных связей
•Это сходство обусловлено следующим:
1)У переносчика имеется специфический участок связывания для переносимого вещества
2)Процесс переноса характеризуется насыщением, т.е. существует величина Vmax – максимальная скорость переноса
3)Существует величина K, аналогичная KM для ферментативной кинетики, которая характеризует сродство между переносчиком и переносимым веществом
4)Вещества, сходные по структуре с переносимым веществом, являются конкурентными ингибиторами транспорта этого вещества
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
Облегченная диффузия с помощью переносчиков
•Процессы транспорта с участием переносчиков описываются законом, аналогичным уравнению ферментативной кинетики:
I = ImaxΔc/(K+Δc), |
V max |
|
|
|
|
Диффузия с помощью |
|
|
|
|
|
|
|
|
белка переносчика |
где Imaxмаксимально достигаемый |
|
|
|
поток вещества через мембрану; |
|
|
|
Δc – градиент концентраций |
V max/2 |
|
|
переносимого вещества; |
|
|
|
транспорта |
|
|
|
К – константа сродства между |
|
|
|
переносчиком и переносимым |
|
|
|
веществом |
|
|
|
Скорость |
|
|
|
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. |
K M |
Концентрация |
|
Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак. |
транспортируемых молекул |
||
Механизм транспорта"пинг-понг"с участием белка-переносчика
Транспортируемое |
|
|
|
А |
||
вещество |
А |
"Понг" |
"Пинг" |
А |
А |
А |
|
||||||
|
|
|
|
|||
Градиент
концентрации
Транспортный белок, осуществляющий |
А |
А |
|
|
|
облегчённую диффузию |
|
|
1)Белок-переносчик связывает вещество, находящееся в растворе с его высокой концентрацией по одну сторону мембраны.
2)Изменение конформации белка ("понг" – "пинг") - вещество А высвобождается по другую сторону мембраны.
Этот документ3) Свободныйбыл отредактирован спереносчикIcecream PDF Editor. возвращается в исходное состояние
Активируйте("пинг"PRO версию, чтобы- "понг")убрать водянойизнакцикл. завершается.
Переносчик глюкозы в мембранах эритроцитов (пример)
Переносчик глюкозы (GLUT)- гликопротеин, содержит 12 трансмембранных α-спиральных участков, в мембране ориентирован асимметрично и в виде димера.
Это – унипортер, катализирующий облегченную диффузию только глюкозы. Облегченная диффузия – унипорт – транспорт одного вещества в одном направлении (глюкоза в клетках печени).
Конформационные изменения молекулы зарегистрированы методом ИКспектроскопии с Фурье-преобразованием – скольжение α-спиралей друг
Этототносительнодокумент был отредактировандругас Icecream. PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
На каталитические функции белка оказывает влияние структура полярных головок фосфолипидов.
Транспорт глюкозы в эритроциты
Белки-переносчики претерпевают обратимые конформационные изменения
Этот документ был отредактирован с Icecream PDF Editor. Активируйте PRO версию, чтобы убрать водяной знак.
