Все лк фарм бт
.pdf
Повреждение животных клеток при барботаже
|
Барботаж газа в культуральной |
|
жидкости вызывает повреждение |
|
животных клеток, находящихся в |
|
суспензии. |
|
Несмотря на это, биореакторы с |
|
барботажем остаются основным типом |
53 |
реакторов из-за высокой эффективности |
|
доставки кислорода, особенно в |
|
промышленном масштабе. |
Механизмы повреждения клеток:
1.Схлопывание пузырьков с развитием высоких динамических нагрузок вокруг пузырька
2.Сдвиговые нагрузки в текущей плёнке жидкости внутри пены
Handa, A & Emery, A & Spier, Ray. (1987). On the Evaluation of Gas—Liquid Interfacial Effects on Hybridoma Viability in Bubble Column Bioreactors. Developments in biological standardization. 66. 241-53.
Повреждение животных клеток при барботаже происходит, в основном, на поверхности жидкости
55
Handa, A & Emery, A & Spier, Ray. (1987). On the
Evaluation of Gas—Liquid Interfacial Effects on
Hybridoma Viability in Bubble Column Bioreactors.
Developments in biological standardization. 66. 241-53.
Повреждение животных клеток при барботаже зависит от природы клеток и размера пузырьков.
56
Handa, A & Emery, A & Spier, Ray. (1987). On the
Evaluation of Gas—Liquid Interfacial Effects on
Hybridoma Viability in Bubble Column Bioreactors.
Developments in biological standardization. 66. 241-53.
Клеточная смерть
|
Гибель клеток снижает общий выход продукта, и это может быть |
|
проблемой биопроцесса. Животные клетки погибают путем некроза и |
|
апоптоза. |
|
Некроз – это внезапная смерть, вызванная очень неблагоприятными |
|
условиями, такими как экстремальный уровень pH и механический стресс. |
|
Некротическая клетка не способна поддерживать осмотическое давление, |
|
что приводит к набуханию клеток с последующей потерей целостности |
|
мембраны. В итоге внутриклеточные компоненты попадают в окружающую |
|
среду. |
|
Апоптоз является запрограммированным и генетически контролируемым. |
57 |
Ограничение в питательных субстратах, ограничение кислорода, |
|
накопление токсичных метаболитов, потеря адгезивности и дефицит |
факторов роста являются примерами событий, которые могут вызвать апоптоз. Апоптотические клетки появляются обычно на последних этапах периодической культуры
Ключевые параметры процесса культивирования
Питательная среда определяет:
-выживание и скорость пролиферации клеток
-продуктивность процесса культивирования
-качество целевого белка
58
«Питательная среда – это не важная часть процесса, это самая важная часть процесса»
История разработки питательных сред
1882-1907 гг.
Всё началось с простых солевых растворов из неорганических компонентов, в которых ткани или клетки могли поддерживать жизнеспособность некоторое ограниченное время (растворы Рингера, Ёрла, Хэнкса и др.)
1907-
Активное использование плазмы крови и эмбриональных экстрактов для культивирования разных типов клеток теплокровных животных.
1911-
Первые попытки выяснить, какие компоненты в плазме и экстрактах 59 ответственны за поддержание роста клеток. Была выявлена важность
глюкозы и аминокислот, а также белковой фракции плазмы.
История разработки питательных сред
1940-
Были получены первые постоянные линии клеток, с помощью которых стало проще разрабатывать составы сред.
Две стратегии разработки:
1) диализ сыворотки и изучение влияния низкомолекулярных компонентов, 2) полный отказ от сыворотки и попытка вырастить клетки на более контролируемой среде.
Гарри Игл обнаружил незаменимость 13 аминокислот и 8 витаминов (1955). Затем к списку используемых компонентов добавились: жирорастворимые
60 |
витамины, железо, предшественники нуклеиновых кислот. |
|
|
|
Позднее выяснилось, что для безбелкового культивирования клеток требуется |
|
большое количество микроэлементов (Al, Ag, Ba, Br, Cd, Co, Cr, F, Ge, I, Mn, Mo, |
|
Ni и пр.) |
Сыворотка крови – источник следующих компонентов:
|
гормонов |
|
|
факторов роста |
|
|
факторов адгезии |
|
|
структурных и транспортных белков |
|
|
липидов |
|
61 |
ингибиторов протеаз |
|
низкомолекулярных нутриентов |
||
|
История разработки питательных сред
1970-
Было обнаружено много ростовых факторов, которые способны частично заменить функцию сыворотки (фактор роста нервов, эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов и др.). Также было обнаружено позитивное влияние селенита, альбумина и трансферрина.
1978-
Прорыв в производстве рекомбинантных белков привёл к бурному росту количества исследований, посвящённых разработке бессывороточных
62 |
питательных сред. |
|
|
|
Основной прорыв за счёт использования анализа метаболических путей, |
|
геномных и протеомных исследований. |