12. Трансляция мРнк у прокариот. Условия инициации. Элонгация полипептидной цепи. Терминация элонгации полипептидной цепи.
Трансляция мРНК у прокариот
Трансляция — это процесс синтеза белка (полипептидной цепи) на матрице мРНК (информационной РНК). У прокариот (например, у E. coli) этот процесс происходит на 70S-рибосомах, которые состоят из двух субъединиц:
30S-субъединица (малая), содержащая 16S рРНК (рибосомальную РНК) и некоторое количество рибосомных белков.
50S-субъединица (большая), содержащая 23S рРНК, 5S рРНК и рибосомные белки.
Полипептидные цепи синтезируются однонаправленно: с N-конца к C-концу. При этом карбоксильная группа уже образовавшегося участка полипептидной цепи соединяется с аминогруппой следующей присоединяемой аминокислоты пептидной связью. Трансляция продолжается в направлении (АUG) 5' → 3' до тех пор, пока не достигнет стоп-сигнала, расположенного сразу же за кодоном, детерминирующим С-концевую аминокислоту
Во многом процесс похож на эукариотический, но есть ряд важных отличий, среди которых наличие у прокариот инициаторной аминокислоты N-формилметионина (fMet), а также характерные особенности сайтов связывания рибосомы с мРНК — Shine-Dalgarno (SD) последовательность.
Условия инициации.
Shine-Dalgarno-последовательность
У прокариот для начала трансляции необходимо узнавание Shine-Dalgarno (Шайна-Дальгарно) богатая пуринами последовательность комплиментарно связывается с полипиримидиновым участком в близи 3’ конца - (SD-последовательности) на мРНК.
Расположение: обычно эта последовательность находится примерно за 6–10 нуклеотидов до старт-кодона (AUG или GUG, реже UUG).
Функция: SD-последовательность комплементарна участку 16S рРНК в составе 30S-субъединицы. Благодаря этому контакту мРНК «правильно» позиционируется в рибосоме так, чтобы старт-кодон располагался в P-сайте рибосомы.
70S-рибосома способна осуществлять трансляцию последовательности мРНК, но не может инициировать этот процесс. При связывании инициаторных белков IF-1 и IF-2 с 30S-субчастицей происходит диссоциация 70S-рибосомы. 30S-субчастица в комплексе с IF-1 и IF-3 связывает IF-2, GTP и Fmet тРНК Met F. Такой полный комплекс связывается с 5'-концом кодирующей последовательности мРНК вблизи кодона AUG. Очевидно, IF-2 способен отличить Fmet-тРНК Met F от met-тРНК Met Met M, и эта специфичность отчасти обеспечивается N-формилной группой, отсутствующей у met-тРНК Met M. Формирование полноценного функционального комплекса инициации завершается ассоциацией 50S-субчастицы с преинициаторным комплексом. С образованием функциональной 70S-субъединицы отделяются все три белка инициации. Процесс инициации также зависит от вторичной структуры того участув молекулы мРНК, в котором находится инициаторный кодон AUG. Если этот кодон будет внутри двуцепочного участка, то инициация неэффективна или блокируется.
IF1: связывается с 30S-субъединицей и блокирует А-сайт, предотвращая преждевременное присоединение tRNA.
IF2: белок, обладающий GTPазной активностью; узнаёт и связывает именно fMet-tRNA_\text{fMet}, способствует её доставке к P-сайту рибосомы.
IF3: способствует диссоциации 70S-рибосомы на 30S и 50S, а затем не даёт 30S «преждевременно» ассоциироваться с 50S до момента, пока не будут выполнены необходимые условия для инициации.
Элонгация полипептидной цепи.
При ассоциации двух рибосомных субчастиц перед инициацией трансляции образуются два функциональных участка, необходимых для сборки белка: Р- и А-участки. Fmеt-тРНКМеtF занимает Р-участок, а для образования первой пептидной связи необходимо, чтобы аминоацил-тРНК, соответствующая следующему кодону, заняла А-участок. Для этого аминоацил-тРНК должна сначала связать EF-Тu и GTP. Образовавшийся тройной комплекс (аминоацил-тРНК-[EF-Tu-GTP]) и доставляет аминоацил-тРНК к А-участку. GTP в это время гидролизуется, и комплекс (EF-Tu-GDP) отделяется от рибосомы. Когда оба участка, А и Р, заняты, пептидилтрансферазная активность 50S-субчастицы катализирует перенос группы Fmet с ее тРНК на аминогруппу аминоацил-тРНК, находящейся в А-участке. В результате в А-участке оказывастся дипептидил-тРНК, а в Р-свободная тРНК.
Для прочтения следующего кодона и удлинения полипептидной цепи еще на одну аминокислоту вся серия реакций должна повториться. Однако, прежде чем это произойдет, тРНК должна освободить Р-участок, образовавшаяся дипептидил-тРНК должна переместиться на него, а новый кодон должен быть готов к тому, чтобы занять освободившийся А-участок. Все эти процессы осуществляются с помощью EF-G при GTP-зависимой транслокации рибосомы.
Источником энергии для перемещения рибосомы к следующему триплету кодирующей последовательности и удаления свободной тРНК из Р-сайта служит реакция гидролиза GTP до GDP. Теперь новый кодон, занявший А-сайт, готов к спариванию с родственной аминоацил-тРНК. Сразу после связывания аминоацил-тРНК с А-участком высвобождается комплекс EF-Tu-GDP и происходит регенерация функционально активного EF-Tu-GTP. При этом EF-Tu-GDP взаимодействует с белком EF-Ts, что приводит к отделению GDP и образованию комплекса EF-Tu EF-Ts. Далее EF-Tu EF-Ts взаимодействует с GTP, происходит регенерация EF-Tu-GTP и отделение EF-Ts, и оба соединения оказываются готовыми к следующему циклу.
Необходимо отметить несколько особенностей процесса элонгации.
1. При образовании каждой пептидной связи расходуется энергия, равная че тырем энергетическим эквивалентам (если за один эквивалент принять энергию образования фосфатной связи): два эквивалента АТР потребляются при аминоацилировании тРНК и два эквивалента GTP в каждом цикле элонгации.
2. При инициации трансляции IF-2 узнает Fmet-тРНКМetF среди всех других аминоацил-тРНК, а EF-Tu отличает met-тРНК МetF от met-тРНКМetМetM при внедрении в А-участок.
3. Факторы элонгации EF-Tu и EF-G то присоединяются, то отделяются от рибосомы в зависимости от того. связаны ли они с GTP или с GDP соответственно.
4. Растущая полипептидная цепь всегда соединена своим карбоксильным концом с тРНК, которая соответствует С-концевой аминокислоте в растущей полипептидной цепи.
5. Пептидилтрансфераза катализирует формирование пептидных связей между карбоксильным концом растущей цепи и аминогруппой аминоапил-тРНК.
Терминация элонгации полипептидной цепи.
Процесс последовательной трансляции кодонов в конце концов доходит до того момента, когда в А-участке оказывается один из трех терминирующих кодонов- UAG, UAA или UGA. Из-за отсутствия тРНК, отвечающих этим кодонам, полипептидил-тРНК остается связанной с Р-участком. Здесь вступают в действие специфические факторы RF-1 и RF-2, которые катализируют отсоединение полипептидной цепи от тРНК, отделение их обоих от рибосомы, а 70S-рибосомы от мРНК. RF-1 узнает в А-участке кодон UAA или UAG; RF-2 включается в том случае, когда в А-участке оказывается UAA или UGA; RF-3 облегчает работу двух других факторов. Если терминирующим кодоном является UAA, то эффективность процесса терминации оказывается наибольшей, поскольку этот кодон узнают оба фактора- RF-1 и RF-2. Однако, каким бы из стоп-кодонов ни обеспечивалась терминация, ее эффективность зависит от фланкирующих эти кодоны последовательностей в мРНК. Хотя общие черты и даже некоторые детали процесса терминации известны, точный его механизм и каталитическая роль факторов RF-1 и RF-2 пока неясны.
1. RF-1 или RF-2 вместо тРНК связыватся с кодоном в сайте A
2. Пептидилтрансфераза катализирует реакцию молекулы воды с активированной пептидной цепью
3. Полипептидная цепь освобождается
4. тРНК и мРНК освобождаются
5. 50S и 30S субчастицы диссоциируют