7. Репарация днк. Повреждения в структуре днк. Репарация путем прямого восстановления исходной структуры. Репарация путем замены модифицированных остатков. Значение репарации днк.

Репарация ДНК - процесс восстановления поврежденных участков ДНК.

Виды и причины повреждений

1) Наиболее часто происходит разрыв гликозидной связи в пуриновых нуклеотидах (апуринизация). Также происходит дезаминирование цитозина и аденина (100 на геном в сутки).

2) Многие изменения происходят под воздействием химических веществ – алкилирующих агентов (азотистые соединения, алкилсульфонаты, нитрозомочевина), интеркаляторов (бромистый этидий, ароматические соединения), бифункциональных агентов (сшивки между цепями ДНК азотистым ипритом).

3) Изменения происходят под действием физических факторов (УФ-излучение, радиация, температура)

Например, образование димеров между соседними пиримидинами.

Основные типы репарационных процессов

1) Непосредственное исправление модификаций или неправильных спариваний, не требующее репликации для восстановления исходной структуры.

2) Удаление нуклеотидов, окружающих ошибочно спаренные или измененные пары оснований, и ресинтез этого участка путем репликации.

Прямая репарация, при которой повреждение просто удаляется или исправляется на месте, встречается редко. Хорошим примером служит фотореактивация пиримидиновых димеров, при которой проблемные ковалентные связи восстанавливаются светозависимым ферментом - фотолиазой. Данный фермент образует комплекс с фрагментом ДНК, где произошла сшивка оснований и под воздействием света (300-600 нм) восстанавливает повреждённый участок. Такой фермент есть у бактерий, низших эукариот, но не обнаружен у млекопитающих.

Другой пример – деалкилирование гуаниновых остатков ДНК-алкилтрансферазой, которая катализирует перенос алкильных фрагментов с гуанина на цистеиновые остатки фермента. Этот фермент есть у бактерий и млекопитающих.

Замена модифицированного нуклеотида происходит в 4 этапа.

1) Фермент распознаёт повреждённый участок и либо разрезает цепь вблизи него, либо выщепляет модифицированное основание от сахаро-фосфатного остова.

2) Экзонуклеаза удаляет модифицированный нуклеотид и/или несколько нуклеотидов рядом с ним.

3) Синтез удалённого участка заново от 3’-конца с использованием противоположной цепи как матрицы.

4) Концы разрыва после репарации сшиваются с восстановлением целостности цепи.

Сайты с депуринизацией или депиримидинизацием выщепляются AP-эндонуклеазами. В репарации модифицированных нуклеотидов играют роль ДНК N-гликозилазы – ферменты, расщепляющие гликозидную связь. Фермент оставляет пробелы в местах выщепления, которые затем восстанавливаются ферментами ресинтеза (полимеразы, лигазы).

Репарация тиминовых димеров может происходить в темноте двумя способами.

В клетках E.coli образуется комплекс uvrABC-эндонуклеазы, который разрезает цепь ДНК с двух сторон от пиримидинового димера ( 8 фосфодиэфирных связей с 5’-конца и 4-5 связей с 3’-конца). Удаление катализируется геликазой. Полученный пробел заполняется ДНК-полимеразой I, а затем концы сшиваются лигазой.

В других организмах репарация происходит с помощью гликозилазы. Гликозидная связь расщепляется так, что димер остаётся на 5’-конце, а гидроксильная группа на дезоксирибозе с 3’-конца. Образовавшийся 3’-AP конец отщепляется экзонуклеазным доменом ДНК-полимеразы, а затем с помощью ник-трансляции и лигирования удаляется нуклеотид с прилежащим тиминовым димером. Затем пробел заполняется, а концы сшиваются лигазой.

Синтез через повреждение

Прямая репликация после повреждения ДНК —процесс, известный как синтез через повреждение (транслезионный синтез) (TLS) — осуществляется специализированными ДНК-полимеразами, наиболее распространенным классом которых являются те, которые относятся к Y-семейству. Синтез трансляции (TLS) - это многоступенчатый процесс. было предложено несколько моделей, описывающих возможные сценарии, по которым дальше будет протекать ТЛС.

В условиях генотоксического стресса системы репарации не всегда исправляют повреждения, которые остаются в структуре ДНК. Встречая повреждение в ходе репликации, ДНК-полимеразы останавливаются, тормозя репликацию молекулы ДНК. Неоконченная репликация хромосом представляет опасность для клетки; для предотвращения её гибели предусмотрена транслезионная система репарации, функционирующая в тех случаях, когда необходимо восстановить геном любой ценой. В таких случаях ферменты – транслезионные ДНК-полимеразы – продолжают синтез цепи даже после контакта с объёмным повреждением структуры, например, циклобутановыми пиримидиновыми димерами.

Выбор вставляемого нуклеотида происходит неслучайным образом: некоторые транслезионные ДНК-полимеразы специфичны к определённым нуклеотидам. Примером такой специфичности может служить человеческая ДНК-полимераза Pol η, принадлежащая к Y-семейству белков. Она способна встраивать напротив тиминовых димеров два аденозина. После преодоления повреждения репликативные белки продолжают свою работу.

У прокариот транслезионный синтез осуществляется полимеразами IV и V. Полимераза IV представлена одним белком DinB, полимераза V – комплексом белков UmuC и UmuD’ в стехиометрическом соотношении 1:2.

Белки транслезионных систем репарации эукариот принадлежат к 5 подсемействам Y-семейства (Rev1, UmuC, DinB/Pol κ, Pol ι, Pol η) и одному подсемейству, не входящему в Y-семейство [Pol ζ (Rev3/Rev7)]. Такое разнообразие транслезионных ДНК-полимераз позволяет репликативной вилке преодолевать различные формы повреждений структуры ДНК.

Транслезионные ДНК-полимеразы в целом не обладают высокой специфичностью к включаемому в растущую последовательность нуклеотиду, т. е. встраивают его независимо от нуклеотида, стоящего в матричной цепи. Такая неточность может приводить к мутациям (транзициям и трансверсиям), из-за чего экспрессия транслезионных ДНК-полимераз жёстко регулируется.

В клетках прокариот функционирует SOS-система, управляющая экспрессией различных белков, в том числе транслезионных ДНК-полимераз. В регуляторных последовательностях белков SOS-системы находится консервативная последовательность – SOS-бокс, с которым в норме связывается репрессор LexA. В случае большого числа повреждений, например, тиминовых димеров, в клетке образуется много протяжённых одноцепочечных участков ввиду частичной остановки репликации. С ними связывается белок RecA, также контролируемый SOS-системой и экспрессируемый в норме на низком уровне. Активированный белок RecA связывается с LexA, запускает аутопротеазную функцию последнего, т. е. LexA начинает сам себя расщеплять. Он перестаёт сдерживать работу ферментов SOS-системы. Во время активной стадии репарации SOS-системой белок RecA необходим для расщепления UmuD, неактивного белка-предшественника UmuD’. Последний, связываясь с UmuC, формирует полимеразу V.

Таким образом, начинается активная экспрессия ферментов репарации, исправляющих повреждения. По окончании репарации одноцепочечные участки ДНК исчезают, в результате чего RecA больше не активируется, а белок LexA перестаёт разрушаться и начинает подавлять эксперссию генов, кодирующих белки SOS-системы, и их синтез прекращается.

У эукариот ДНК-полимеразы – как репликативные, так и транслезионные – функционируют в клетке в составе мультибелкового комплекса и активируются белком PCNA. Чтобы PCNA подключился к синтезу транслезионных полимераз вместо репликативных используется механизм убиквитинирования. Так, активность полимераз Rev1 и Pol η возрастает при связывании с убиквитинированным белком PCNA в сравнении с немодифицированным PCNA.

Сверхэкспрессия транслезионных ДНК-полимераз, обладающих низкой точностью, приводит к повышенному мутагенезу. Дефицит этих ферментов также оказывает негативное влияние. Недостаток экспрессии белка Pol η повышает чувствительность к УФ-излучению, приводит к предрасположенности к онкологическим заболеваниям и вариантной форме пигментной ксеродермы.

Значение репарации ДНК

У клеток в процессе эволюции выработался сложный механизм устранения повреждений, возникающих в ДНК под действием самых разнообразных химических и физических факторов, а также вследствие ошибок при репликации и рекомбинации. И это вполне понятно: большая часть повреждений блокирует передачу генетической информации последующему поколению, а остальные, если их не устранить, сохранятся в геномах потомков и приведут к драматическим изменениям в молекулах белков, в том числе и ферментов, необходимых для поддержания жизнедеятельности клетки. При повреждении определенных звеньев системы репарации клетки становятся особенно уязвимыми для некоторых химических и физических агентов. Например, клети E.coli, у которых нарушена система внесения разрывов в ДНК при выщеплении тиминовых димеров, очень чувствительные к УФ-свету. Клетки, неспособные осуществить ту или иную N-гликозилазную реакцию, гораздо больше, чем нормальные, подвержены мутагенному или летальному эффекту алкилирующих агентов или ионизирующей радиации. У клеток E.coli, дефектных по Pol 1, существенно снижена выживаемость при облучении низкими дозами УФ-света.

У представителей низших эукариот, дрожжей имеется по крайней мере 5 генов, кодирующих белки, которые участвуют во внесении разрывов в УФ-облученную ДНК. Нарушение только в одном из этих 5 RAD-генов приводит к тому, что клетки утрачивают способность к внесению разрывов в ДНК и, следовательно, к удалению пиримидиновых димеров. У дрожжей существуют также мутанты с нарушенной способностью к удалению сшивок между цепями, хотя элиминация УФ-индуцированных повреждений проходит нормально. Это предполагает, что у дрожжей, как и у человека, для удаления поперечных сшивок, а возможно и для исправления множества других химических модификаций в ДНК существуют специфические, весьма сложные механизмы репарации.

Люди, страдающие пигментной ксеродермой, очень чувствительны к УФ-свету, и у них развиваются разные формы рака кожи даже при очень слабом воздействии солнечного света. Клетки таких людей несут мутацию, сходную с RAD-мутацией дрожжей и проявляющуюся в том, что у них нарушена способность к выщеплению пиримидиновых димеров из УФ-облученной ДНК. Заболевание может быть обусловлено мутацией в одно из 9 генов, что говорит о достаточно сложном механизме репарации ДНК, содержащей тиминовые димеры у человека. Как правило, заболевание бывает связано с неспособностью к выщеплению тиминовых димеров. Если к облученным клеткам в культуре добавить фермент, обладающий тиминдимергликозилазной и AP-эндонуклеазной активностями, то УФ-повреждения могут быть устранены.

8. Рекомбинация ДНК. Типы рекомбинации. Общая рекомбинация при согласованном внесении разрывов и воссоединении цепей двух спиралей ДНК с образованием протяженных гетеродуплексных областей (Модель Холидея).

Создание новых комбинаций элементов носителей генетической информации обусловлено генетической рекомбинацией.

Существуют три типа рекомбинации: общая (гомологичная), сайт-специфическая, случайная (негомологичная)

1. Гомологичная генетическая рекомбинация (или общая рекомбинация) представляет собой обмен генами между двумя любыми молекулами ДНК (или участками одной и той же молекулы), которые содержат протяженные отрезки почти идентичной последовательности нуклеотидов. Последовательности могут быть любыми, главное, чтобы они были похожими. Гомологичная генетическая рекомбинация обычно используется для репарации двухцепочечных разрывов в ДНК. Также гомологичная рекомбинация протекает во время мейоза (кроссинговер). Обычно рекомбинация происходит между гомологичными и аллельными участками ДНК. Однако в неравном кроссинговере происходит рекомбинация между гологичными, но не аллельными фрагментами ДНК (один дуплекс ДНК утрачивает сегмент ДНК, а второй приобретает лишний). Бывает нереципрокная рекомбинация (генная конверсия): один из продуктов рекомбинации идентичен исходной молекуле, а второй - отличен от обоих партнёров рекомбинации.

2. При сайт-специфической рекомбинации происходит обмен только определенных последовательностей ДНК. Специфический фрагмент может быть только в одном дуплексе ДНК (транспозиция мобильных элементов) или сразу в обоих дуплексах ДНК (встраивание ДНК фага лямбда в хромосому E. coli). В отличие от гомологичной рекомбинации при сайт-специфической обмениваемые участки ДНК довольно короткие (около 25 нуклеотидов).

3. Случайная или негомологичная рекомбинация – рекомбинация между негомологичными нуклеотидными последовательностями, которая происходит в клетках прокариот и дрожжей достаточно редко, а в клетках млекопитающих весьма часто. К негомологичной рекомбинации можно отнести процесс случайного встраивания вирусной или плазмидной ДНК в ДНК клеток животных.

Во время мейоза происходит гомологическая рекомбинация с образованием двухцепочечного разрыва. Хромосомы гипотетической диплоидной клетки зародышевой линии (см. Рис. ниже) (четыре хромосомы; две гомологичные пары) реплицируются и остаются соединенными центромерами. Реплицированные двухцепочечные молекулы ДНК называются хроматидами (сестринские хроматиды). В профазе I непосредственно перед первым мейотическим делением

два набора гомологичных хроматид выстраиваются в тетрады (биваленты), удерживаемые вместе ковалентными связями в местах гомологичных соединений (хиазм). В хиазмах происходит кроссинговер. Такие временные ассоциации между гомологами обеспечивают правильность расхождения хромосом на следующей стадии, когда прикрепленные

волокна веретена тянут их к противоположным полюсам делящейся клетки в первом мейотическом делении. Продуктами такого деления являются две дочерние клетки, каждая из которых содержит по две пары сестринских хроматид. Затем пары выстраиваются на экваторе клетки и подготавливаются к разделению хроматид (теперь они называются хромосомами). В результате второго мейотического деления образуются четыре гаплоидные дочерние клетки, которые могут выступать в роли гамет. Каждая из этих клеток содержит две хромосомы — половинный набор диплоидной клетки-предшественницы. Хромосомы подверглись перераспределению и рекомбинации.

Итак, гомологичная рекомбинация выполняет по меньшей мере три функции: 1) используется в репарации нескольких типов повреждений ДНК; 2) в клетках эукариот обеспечивает временную физическую взаимосвязь между хроматидами, необходимую для точного расхождения хромосом на первой стадии мейотического деления; 3) усиливает генетическое разнообразие в популяции.

Общая рекомбинация при согласованном внесении разрывов и воссоединении цепей двух спиралей ДНК с образованием протяженных гетеродуплексных областей.

Чтобы могла пройти рекомбинация между двойными спиралями, каждая из четырех цепей должна быть разорвана и затем соединена с новым партнером.

(1-3) Соответствующие цепи обоих линейных гомологичных дуплексов ДНК надрезаются и свободные концы одной спирали спариваются с комплементарными участками другой.

(4) Перекрест стабилизируется сшиванием концов донорных цепей со свободными концами реципиентных спиралей.

(5) Точка перекреста обменивающихся цепей перемещается вдоль спиралей (миграция ветвей)

(6) При этом происходит одновременное расхождение исходных спиралей и их реассоциация с новыми партнерами с образованием дочерних дуплексов. Структуры Холлидея могут переходить в рекомбинативные двойные спирали путем внесения разрыва и воссоединения цепей двумя альтернативными способами.

1) Альтернативные продукты образуются в случае, если структура Холлидея переходит в результате разрыва в другой структуре. (Разрыв 1)

2) Cпособ состоит в разрезании и воссоединении перекрещивающихся цепей. Два реципрокных продукта могут образоваться, если разрыв и последующее воссоединение цепей произойдут в точке перекреста или по линии пересечения четырех цепей в изомерной структуре Холлидея. Размер обменивающихся фрагментов зависит от расстояния, на которое произошла миграция ветви до акта рекомбинации. (Разрыв 2)

В основе рекомбинации данного типа лежит гомологичное спаривание цепей, принадлежащих двум разным спиралям ДНК, поэтому скорее всего она произойдет в том месте, где такое спаривание возможно априори и где гомологичность последовательностей достаточно велика, чтобы могла произойти миграция ветви в рамках структуры со скрестившимися цепями. Отсюда можно понять, почему общая, или гомологичная, рекомбинация происходит также между двумя повторами в пределах одной молекулы ДНК или между аллельными и неаллельными элементами одной и той же последовательности в двух разных хромосомах.

В ходе миграции ветви при спаривании цепей, принадлежащих разным спиралям, образуются гетеродуплексы. В таких гетеродуплексах в пределах сегмента между сайтом начала образования структуры Холлидея и сайтом кроссинговера может содержаться по одному или более ошибочно спаренных оснований. Они удаляются так же, как любых модифицированные основания при репарации ДНК. Однако, поскольку удалено может быть любое из ошибочно спаренных оснований, в обеих рекомбинантых спиралях в данном сайте могут оказаться одинаковые пары оснований, т. е. рекомбинация для этого сайта окажется нереципрокной. Таким образом, каждая из рекомбинантых спиралей может быть похожа на любой из начальных дуплексов в тех позициях, где исходно они различались.

9. Рекомбинация ДНК. Типы рекомбинации. Общая рекомбинация с образованием двухцепочечного разрыва. (Тутаев)

Перекомпоновка генетической информации внутри молекул ДНК и между ними осуществляется в результате многих процессов, обобщенно называемых генетической рекомбинацией. Выделяют три основных типа генетической рекомбинации:

1. Гомологичная генетическая рекомбинация (или общая рекомбинация) представляет собой обмен генами между двумя любыми молекулами ДНК (или участками одной и той же молекулы), которые содержат протяженные отрезки почти идентичной последовательности нуклеотидов. Последовательности могут быть любыми, главное, чтобы они были похожими. Гомологичная генетическая рекомбинация обычно используется для репарации двухцепочечных разрывов в ДНК. Также гомологичная рекомбинация протекает во время мейоза (кроссинговер). Обычно рекомбинация происходит между гомологичными и аллельными участками ДНК. Однако в неравном кроссинговере происходит рекомбинация между гологичными, но не аллельными фрагментами ДНК (один дуплекс ДНК утрачивает сегмент ДНК, а второй приобретает лишний). Бывает нереципрокная рекомбинация (генная конверсия): один из продуктов рекомбинации идентичен исходной молекуле, а второй - отличен от обоих партнёров рекомбинации.

2. При сайт-специфической рекомбинации происходит обмен только определенных последовательностей ДНК. Специфический фрагмент может быть только в одном дуплексе ДНК (транспозиция мобильных элементов) или сразу в обоих дуплексах ДНК (встраивание ДНК фага лямбда в хромосому E. coli). В отличие от гомологичной рекомбинации при сайт-специфической обмениваемые участки ДНК довольно короткие (около 25 нуклеотидов).

3. Случайная или негомологичная рекомбинация – рекомбинация между негомологичными нуклеотидными последовательностями, которая происходит в клетках прокариот и дрожжей достаточно редко, а в клетках млекопитающих весьма часто. К негомологичной рекомбинации можно отнести процесс случайного встраивания вирусной или плазмидной ДНК в ДНК клеток животных.

Во время мейоза происходит гомологическая рекомбинация с образованием двухцепочечного разрыва. Хромосомы гипотетической диплоидной клетки зародышевой линии (см. Рис. ниже) (четыре хромосомы; две гомологичные пары) реплицируются и остаются соединенными центромерами. Реплицированные двухцепочечные молекулы ДНК называются хроматидами (сестринские хроматиды). В профазе I непосредственно перед первым мейотическим делением

два набора гомологичных хроматид выстраиваются в тетрады (биваленты), удерживаемые вместе ковалентными связями в местах гомологичных соединений (хиазм). В хиазмах происходит кроссинговер. Такие временные ассоциации между гомологами обеспечивают правильность расхождения хромосом на следующей стадии, когда прикрепленные

волокна веретена тянут их к противоположным полюсам делящейся клетки в первом мейотическом делении. Продуктами такого деления являются две дочерние клетки, каждая из которых содержит по две пары сестринских хроматид. Затем пары выстраиваются на экваторе клетки и подготавливаются к разделению хроматид (теперь они называются хромосомами). В результате второго мейотического деления образуются четыре гаплоидные дочерние клетки, которые могут выступать в роли гамет. Каждая из этих клеток содержит две хромосомы — половинный набор диплоидной клетки-предшественницы. Хромосомы подверглись перераспределению и рекомбинации.

Итак, гомологичная рекомбинация выполняет по меньшей мере три функции: 1) используется в репарации нескольких типов повреждений ДНК; 2) в клетках эукариот обеспечивает временную физическую взаимосвязь между хроматидами, необходимую для точного расхождения хромосом на первой стадии мейотического деления; 3) усиливает генетическое разнообразие в популяции.

Схема гомологичной рекомбинации с образованием двухцепочечного разрыва прдеставлена на рис. ниже.

(0) Специализированный белок разрывает обе цепи двойной спирали ДНК в одной из рекомбинирующих хромосом.

(1) Экзонуклеаза увеличивает двухцепочечный разрыв в молекуле ДНК, оставляя одноцепочечные участки с 3’-гидроксильной группой на конце. Расщепление 3’-конца происходит медленнее, чем 5’-конца, поэтому образуются липкие концы (в этом процессе участвуют белки, похожие на белок E. coli RecBCD, являющийся нуклеазой и хеликазой).

(2) Выступающий 3’-конец спаривается с комплементарной цепью интактной спирали. В интактной спирали образуется петля. Этот этап ещё называют инвазией цепи. (в этом процессе участвуют белки, похожие на белок E. coli RecA, являющийся рекомбиназой).

(3) Размер петли увеличивается по мере того, как ДНК-полимераза наращивает 3’-конец “вклинившейся цепи” (фиолетовая цепь удлиняется, удлинённый фрагмент - зелёный).

(4) Другой одноцепочечный конец бреши спаривается с комплементарной последовательностью в перемещающейся петле. Образовавшаяся система “праймер-матрица” заполняет брешь (красный фрагмент достраивается; достроенный фрагмент светло-зелёный). Лигирование двух растущих концов с исходными цепями приводит к образованию двойной структуры Холлидея (структуры, в которой две спирали объединены двумя перекрёстами, по одному на каждом конце бреши). Миграция ветви в одном или обоих перекрестах передвигает оба места сцепления в любом направлении, при этом в участках, фланкирующих брешь, могут возникать ошибки. (Миграция ветви происходит с помощью белка, похожего на белок E. coli RuvAB. RuvA узнаёт структуру Холлидея, а RuvB катализирует перемещение ветви).

(5) Разделение структур может идти двумя способами - с перекрёстом (произошёл кроссинговер) и без него (просто репарация разрыва). Разделение структуры Холлидея происходит под действием резольвазы - фермента, разрешающего узлы в структурах Холлидея (образуются липкие концы, соединяемые лигазой). RuvC-подобная нуклеаза разделяет два продукта так, чтобы два продукта несли гены в том же линейном порядке, что и в субстратах (исходных нерекомбинированных хромосомах). Как действует резольваза рисунок ниже.

В данном процессе могут получаться как реципрокные, так и не реципрокные продукты.

10. Транскрипция у прокариот. ДНК-зависимые РНК-полимеразы. Инициация и терминация транскрипции у прокариот. (Тутаев)

Транскрипция - это процесс, в результате которого образуется РНК, комплементарная одной из цепей ДНК (матричной цепи). РНК последовательность идентична кодирующей цепи ДНК (однако T заменены на U). Могут образоваться три основных типа РНК: мРНК (матричная РНК), кодирующая 1 полипептид или несколько полипептидов; тРНК (транспортная РНК), доставляющая аминокислоты в процессе трансляции; рРНК (рибосомная РНК), являющаяся составной частью рибосом. Также могут образовываться специализированные регуляторные, каталитические РНК.

Транскрипция состоит из трёх этапов: инициация, элонгация, терминация.

В транскрипции участвует фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза. ДНК выступает матрицей для синтеза РНК. Для работы РНК-полимеразы нужны NTP (рибонуклеозид-5’-трифосфаты), ионы магния, ион цинка. ДНК-зависимая РНК-полимераза E. coli состоит из пяти субъединиц ɑ2ββ’ω (кор-фермент) и шестой субъединицы - σ (ɑ2ββ’ωσ - холофермент). ɑ нужна для сборки фермента, и она участвует в катализе и во взаимодействии с регуляторными белками. β связывает рибонуклеозиды-5’-трифосфаты, участвует в катализе (инициация и элонгация цепи). β’ отвечает за связывание с ДНК-матрицей. ω отвечает за сборку и ренатурацию РНК полимеразы. σ отвечает за узнавание промотора и инициацию транскрипции. Есть 7 типов σ-субъединиц: они отвечают за узнавание разных промоторов и экспрессию разных генов (σ70 узнаёт гены домашнего хозяйства, то есть то, что нужно для жизни клетки; σ32 - позволяет транскрибировать гены теплового шока и т.д. Число рядом с сигмой обозначает массу субъединицы в кДа).

1) Инициация

Инициация состоит из двух основных стадий: связывание и инициация.

a) Связывание:

Кор-фермент РНК-полимеразы связывается с σ-субъединицей и образуется холофермент. Холофермент связывается со специальным участком перед геном - промотором. Связывание РНК-полимеразы происходит в области, начинающейся примерно за 70 п.н. до точки начала транскрипции и заканчивающейся через примерно 30 п.н. после неё. То есть область промотора расположена на участке между позициями -70 (до начала транскрипции) и +30 (после начала транскрипции). Субъединица σ взаимодействует с двумя ключевыми консенсусными последовательностями: -10 (5’-TAATAAT-3’) [Прибнов-бокс] и -35 (5’-TTGACA-3’). Бывает ещё третий фрагмент UP, богатый AT основаниями, который связывается с ɑ-субъединицей РНК-полимеразы, но он встречается редко. Консенсусные последовательности промотора разделены спейсерами. Изображение промоторов E. coli:

Изменения в нуклеотидной последовательности элементов -35 и -10 могут снижать уровень экспрессии гена или увеличивать его (замена лишь одного нуклеотида может привести к существенному ослаблению связывания РНК-полимеразы с промотором).

После связывания холофермента РНК-полимеразы с промотором образуется сначала закрытый комплекс (РНК связана с нераскрученным дуплексом ДНК). Затем образуется открытый комплекс: ДНК частично раскручивается около позиции -10. Образуется транскрипционный пузырёк (раскручивается около 12 п.н.).

b) Инициация:

Происходят конформационные изменения, и холофермент РНК-полимеразы синтезирует первые нуклеотиды, после чего сдвигается с промотора (высвобождение промотора). При переходе в стадию элонгации σ-субъединица диссоциирует. Белок NusA связывается с РНК-полимеразой вместо σ-субъединицы и начинается элонгация. После окончания транскрипции NusA отсоединяется от фермента, РНК-полимераза диссоциирует с ДНК.

2) Терминация:

Терминация транскрипции происходит в специальных участках ДНК (сигналы терминации). В E. coli есть два типа сигналов терминации: ⍴-зависимый и ⍴-независимый.

a) ⍴-независимый:

⍴-независимый терминатор имеет две отличительные черты: 1) последовательность, транскрипт которой содержит самокомплементарные участки, образующие структуру в виде шпильки, расположенные на расстоянии 15-20 нуклеотидов от предполагаемого конца цепи РНК; 2) матричная цепь содержит консервативную последовательность из трёх остатков A, которые при транскрипции превращаются в три остатка U вблизи 3’-конца шпильки. Когда полимераза достигает сайта терминации, она останавливается. При формировании шпильки в РНК разрывается несколько пар оснований A=U в гибриде РНК-ДНК и нарушаются важные контакты между РНК и РНК-полимеразой, что способствует диссоциации транскрипта.

b) ⍴-зависимый:

В таком типе терминатора нет повторяющихся остатков A в матричной цепи, но обычно присутствует CA-богатая последовательность (rut-элемент - “ро”-используемая последовательность). Белок ⍴ будет связываться со специфическим участком РНК и перемещаться в направлении 5’->3’, пока не достигнет транскрипционного комплекса, остановившегося на сайте терминации. Белок ⍴ обладает ATP-зависимой РНК-ДНК-хеликазной активностью, которая способствует перемещению белка вдоль РНК (при терминации ⍴-белок осуществляет гидролиз ATP). ⍴-белок высвобождает мРНК и позволяет РНК-полимеразе диссоциировать с ДНК.

11. Аппарат трансляции. Основные особенности структуры тРНК. Этерификация молекул тРНК. Аминоацил-тРНК-синтетазы и их способность к узнаванию аминокислот и родственных тРНК. Генетический код. Взаимодействие кодона и антикодона. Неоднозначное соответствие (wobble). Строение рибосомных частиц. Особые тРНК и некоторые вспомогательные белки, участвующие в трансляции.

Аппарат трансляции.

В процессе трансляции (синтеза белка на рибосомах) участвуют следующие основные компоненты:

1. мРНК (матричная РНК) - Служит «матрицей», на которой рибосома «считывает» информацию, закодированную в виде триплетов (кодонов).

2. тРНК (транспортная РНК) - Специальные молекулы, каждая из которых способна присоединять определённую аминокислоту и распознавать соответствующий кодон мРНК своим антикодоном.

3. Рибосомы - Крупные рибонуклеопротеиновые комплексы (у прокариот — 70S, у эукариот — 80S), состоящие из большой и малой субъединиц (50S и 30S у прокариот; 60S и 40S у эукариот). Содержат рибосомные РНК (рРНК) и белки, осуществляют сборку полипептидной цепи, катализируют образование пептидной связи.

4. Аминоацил-тРНК-синтетазы - Ферменты, которые «заряжают» (аминируют) тРНК правильной аминокислотой. Обеспечивают точность соответствия аминокислоты и антикодона тРНК.

5. Белковые факторы трансляции - Факторы инициации (IF в прокариотах и eIF в эукариотах), факторы элонгации (EF или eEF), факторы терминации (RF или eRF). Они способствуют правильной сборке рибосом, продвижению рибосомы вдоль мРНК, выделению готового полипептида.

Всё это вместе обеспечивает реализацию генетического кода, закреплённого в мРНК, и синтез точных белковых продуктов. В процессе синтеза белка молекула тРНК, нагруженная аминокислотой, должна последовательно состыковаться с молекулой мРНК и через спаривание оснований и сопоставить свой антикодон с очередным кодоном мРНК. После каждого такого сопоставления новая аминокислота должна присоединяться к наращиваемой белковой цепи, а молекула тРНК должна быть «отпущена на волю». Весь этот комплекс процессов выполняется гигантской мультимолекулярной машиной — рибосомой, которая состоит из двух главных цепей РНК, называемых рибосомными РНК (рРНК), и более чем из 50-ти различных белков. Белковая цепь удлиняется на одну аминокислоту, когда рибосома продвигается вдоль молекулы мРНК на один кодон. В принципе, последовательность РНК может быть транслирована при помощи любой из трех разных рамок считывания (reading frames) в зависимости от того, где процесс расшифровки начнется.

Основные особенности структуры тРНК. тРНК-это полинуклеотид 80-100 видов в различных клетках, число нуклеотидов 75-90.

Молекулы тРНК, несмотря на вариабельность по нуклеотидной последовательности, имеют характерную «клеверную» вторичную структуру и L-образную трёхмерную структуру.

Универсальная укладка полинуклеотидной цепи тРНК, названная клеверным листом. Каждому нуклеотиду присвоен свой номер, нумерация идет от 5'- к 3'-концу. Зелеными кружками показаны консервативные или полуконсервативные нуклеотиды. Прямыми линиями обозначены формирующие двойную спираль водородные связи между комплементарными нуклеотидными остатками, их число постоянно во всех тРНК. Пунктиром обозначена непостоянная пара. Нуклеотиды, входящие в антикодон, обозначены розовым цветом. Желтыми овалами показаны нуклеотиды, отсутствующие в структуре многих тРНК. Для единой нрисвоены особые номера. Если тРНК короче 76 нуклеотидов, то пропускается отсутствующий нуклеотид (чаще всего 17-й или 47-й)

Схема L-образной трехмерной структуры фенилаланиновой тРНК, на которой участки полинуклеотидной цепи представлены или в форме свернутой оранжевой ленты, или в форме зеленого тяжа. Двуспиральная область стеблей формируется из двух лент, однонитевые петли изображены тяжами. Видно, что D- и T-петли находятся в очень тесном контакте

1. 5'- и 3'-концы (акцепторный стебель) - Транскрипт тРНК имеет короткий 5'-конец и характерный 3'-конец с последовательностью CCA (обычно добавляется посттранскрипционно), куда к 3'-гидроксилу рибозы присоединяется аминокислота. Именно на свободный 2'- или 3'-гидроксил аденозина в конце CCA присоединяется аминокислота.

2. Антикодоновая петля - Содержит три последовательных нуклеотида (антикодон), которые комплементарно взаимодействуют с кодоном на мРНК.

3. D-петля (дегидроуридиновая) - Содержит модифицированные нуклеотиды (например, дигидроуридин). - Вовлечена во взаимодействие с аминоацил-тРНК-синтетазами и в обеспечение правильной «укладки» тРНК.

4. TψC-петля - Содержит псевдоуридин (ψ). - Участвует во взаимодействии тРНК с рибосомой, стабилизируя «L-образную» структуру.

5. Переменная петля (variable loop) - Может сильно варьировать по длине, что помогает тРНК подстраиваться под различные ферменты и факторы.

Этерификация молекул тРНК.

Чтобы тРНК могла использоваться в трансляции, её нужно «зарядить» соответствующей аминокислотой. Этот процесс называют аминированием или этерификацией тРНК

Каждая молекула аминоацил-тРНК синтетазы состоит из двух основных доменов — аминоацилирующего, в котором располагается активный центр и происходят реакции, и антикодонсвязывающего, узнающего последовательность антикодона тРНК. Также часто встречаются редактирующие домены, служащие для гидролиза аминоацил-тРНК, несущих не тот аминокислотный остаток, и другие домены. Аминоацил-тРНК-синтетазы первого класса — ферменты, переносящие остаток аминокислоты на 2′-ОН группу рибозы; второго класса — ферменты, переносящие остаток аминокислоты на 3′-ОН группу концевой рибозы тРНК.

Аминокислоты по классам аминоацил-тРНК-синтетаз: Класс I: Val, Ile, Leu, Cys, Met, Glu, Gln, Arg, Tyr, Trp Класс II: Gly, Ala, Pro, Ser, Thr, Asp, Asn, His, Phe Для Lys существуют аминоацил-тРНК-синтетазы обоих классов.

1. Первый этап: активация аминокислоты - Аминоацил-тРНК-синтетаза катализирует реакцию аминокислоты с АТФ, образуя аминоацил-АДФ и высвобождая пирофосфат (PPi). - Фермент стабилизирует промежуточный комплекс «кислота-синтетаза».

2. Второй этап: перенос аминокислоты на тРНК - Фермент переносит активированную аминокислоту (из комплекса) на 2'- или 3'-гидроксил аденозина в конце CCA тРНК. - Образуется аминоацил-тРНК (AA-tRNA), готовая к участию в трансляции.

Аминоацил-тРНК-синтетазы и их способность к узнаванию аминокислот и родственных тРНК.

Аминоацил-тРНК - синтетазы связывают одну-единственную аминокислоту с одной или несколькими родственными тРНК

В клетке обычно существует не менее 20 разных аминоацил-тРНК-синтетаз, по одной на каждую из 20 стандартных аминокислот (у некоторых организмов встречаются дополнительные особые AARS для селеноцистеина и др.).

Несколько механизмов, работающих вместе, гарантируют, что тРНК-синтетаза связывает каждую тРНК с верной аминокислотой. Сначала синтетаза должна выбрать правильную аминокислоту — и большинство синтетаз делают это при помощи двухступенчатого механизма.

Во-первых, правильная аминокислота имеет наиболее высокое сродство к «карману» активного участка своей синтетазы, а посему предпочитается остальным 19-ти. В частности, аминокислоты, которые крупнее надлежащей, эффективно изымаются из активного участка. Однако точно различить между собой две подобные аминокислоты, такие как изолейцин и валин (которые отличаются только метильной группой), весьма проблематично для одноступенчатого механизма распознавания.

После того как аминокислота ковалентно связана с АМP, происходит второй этап «опознания». Когда тРНК связывается с синтетазой, она пытается втолкнуть аминокислоту во второй карман синтетазы, точные размеры которого исключают правильную аминокислоту, но допускают введение близкородственных аминокислот. Как только аминокислота попадает в этот «редактирующий карман», ее связь с АМР гидролизуется (или связь с самой тРНК, если связь аминоацил-тРНК уже образовалась к тому времени) и она вы свобождается из фермента. Такое гидролитическое редактирование, которое похоже на экзонуклеолитическую корректировку, осуществляемую ДНК-полимеразами. В большинстве своем тРНК-синтетазы непосредственно узнают соответствующий антикодон тРНК; такие синтетазы содержат три смежных нуклеотидсвязывающих кармана, каждый из которых по форме и заряду комплементарен нуклеотиду в антикодоне. Для других синтетаз ключевым определителем опознания служит последовательность нуклеотидов акцепторного стебля. Однако в бльшинстве случаев синтетаза «считывает» нуклеотиды в нескольких различных позициях тРНК.

Генетический код.

Генетический код — это система, которая описывает, как триплеты нуклеотидов (кодоны) мРНК переводятся в аминокислоты в белке.

Основные свойства генетического кода

1. Триплетность: каждые три нуклеотида мРНК кодируют одну аминокислоту

2. Неперекрываемость: считывание идёт без наложения триплетов друг на друга; один и тот же нуклеотид не может участвовать сразу в двух кодонах.

3. Вырожденность (избыточность): большинство аминокислот кодируются более чем одним триплетом (до 6-ти для некоторых аминокислот).

4. Универсальность: для большинства организмов и вирусов приняты единые правила считывания кодонов (с некоторыми исключениями у митохондрий и некоторых простейших).

5. Однозначность: один кодон кодирует только одну аминокислоту.

Стоп-кодоны и старт-кодон

• Стоп-кодоны: UAA, UAG, UGA — не кодируют аминокислот, а служат сигналами терминации.

• Старт-кодон: обычно AUG (иногда GUG, реже UUG у прокариот) — кодирует метионин (или формилметионин у прокариот).

Взаимодействие кодона и антикодона

Каждый триплет нуклеотидов, или кодон, определяет (кодирует) одну аминокислоту в соответствующем белке. Итак, в распоряжении клетки имеется 64 (4 × 4 × 4) возможных кодона и лишь 20 аминокислот, а это значит, что обязательно будут встречаться случаи, когда одной и той же аминокислоте соответствует несколько кодонов. Код считывается маленькими молекулами РНК, которые выделены в отдельный класс — транспортные РНК (тРНК). На одном конце молекул тРНК прикреплена определенная аминокислота, а на другом выставлена специфическая последовательность из трех нуклеотидов — антикодон — которая и обеспечивает спаривание данной тРНК со специфическим кодоном или подгруппой кодонов в последовательности мРНК.

· Кодон мРНК (5'→3') взаимодействует с антикодоном тРНК (3'→5'), формируя водородные связи между комплементарными основаниями.

· Ключевым является расположение троицы нуклеотидов антикодона в антикодоновой петле.

Неоднозначное соответствие (wobble).

Некоторые аминокислоты имеют более одной тРНК, а некоторые тРНК устроены таким образом, что требуют точного спаривания оснований только в первых двух позициях кодона и толерантны к неоднозначности соответствия, или раскачиванию (wobble), в третьей позиции.

Такое нестрогое спаривание оснований объясняет, почему столь многочисленные альтернативные кодоны для какой-либо одной аминокислоты отличаются только своим третьим нуклеотидом. У бактерий неоднозначное соответствие при спаривании оснований позволяет соотнести 20 аминокислот с 61 кодоном при «посредничестве» лишь 31 вида молекул тРНК.

Если нуклеотид, стоящий в первом столбце, находится в третьем, или «раскачанном» положении кодона (wobble-позиция), он может спариться основанием с любым из нуклеотидов, поставленных во второй столбец. Так, например, когда инозин (I) находится в wobble-позиции антикодона тРНК, тРНК может распознать любой из трех разных кодонов у бактерий и любой из двух кодонов у эукариот. Инозин в молекулах тРНК образуется в результате дезаминирования гуанина— химической модификации, которая происходит в тРНК после ее синтеза. Неканонические пары оснований, а в их числе и те, что образуются с инозином, обычно «слабее», чем канонические пары оснований. Обратите внимание, что спаривание оснований кодон–антикодон является более строгим в позициях 1 и 2 кодона: в них допускаются только классические пары оснований.

Строение рибосомных частиц.

Малая субчастица служит каркасом, на котором молекулы тРНК могут быть точно сопоставлены с кодонами мРНК (см. рис. 6.58), тогда как большая субчастица катализирует образование пептидных связей, которыми аминокислоты связываются между собой в полипептидную цепь

Если рибосома не занята активным синтезом белков, то обе ее субчастицы отделены одна от другой. Они объединяются друг с другом на молекуле мРНК, обычно около ее 5’-конца, — чтобы начать синтез белка. Далее мРНК протягивается сквозь рибосому; по мере того как ее кодоны входят в сердцевину (кор) рибосомы, последовательность нуклеотидов мРНК транслируется в последовательность аминокислот, используя в качестве адапторов тРНК, устанавливающие все аминокислоты в правильной последовательности на конце наращиваемой полипептидной цепи. Когда попадается стоп-кодон, рибосома высвобождает завершенный белок и две ее субчастицы вновь отделяются одна от другой. Эти субчастицы могут быть использованы в дальнейшем — чтобы начать синтез какого-либо иного белка на какой-нибудь другой молекуле мРНК.

Рибосома содержит четыре участка связывания молекул РНК: один предназначен для мРНК, а три (названные A-сайтом, P-сайтом и E-сайтом) для молекул тРНК.

• A-сайт (аминоацильный): сюда приходит аминоацил-тРНК.

• P-сайт (пептидильный): содержит тРНК, несущую растущую полипептидную цепь.

• E-сайт (выходной): отсюда уходит «опустевшая» тРНК.

Молекула тРНК прочно удерживается в А- и P-сайтах, только если ее антикодон образует комплементарные пары оснований с кодоном (с допуском «раскачиваний») на молекуле мРНК, протягиваемой сквозь рибосому. А- и P-участки расположены достаточно близко друг к другу, так что обе втиснутые в них молекулы тРНК могут образовать комплементарные пары оснований с двумя смежными кодонами на молекуле мРНК. Эта особенность рибосомы позволяет придерживаться верной рамки считывания на мРНК. Сразу после инициации синтеза белка каждая новая аминокислота добавляется к растущей цепи в цикле реакций, состоящем из четырех основных шагов: связывание тРНК, образование пептидной связи, транслокация (перемещение) большой субчастицы и транслокация малой субчастицы. В результате двух ступеней транслокации вся рибосома передвигается по мРНК на три нуклеотида и готова начать следующий цикл.

Особые тРНК и некоторые вспомогательные белки, участвующие в трансляции.

Как у про-, так и у эукариот имеются два вида тРНК, которые связывают метионин. У прокариот они обозначаются как тРНК^Met _F и тPHK^Met _M, а у эукариот - тРНК^Met _I и тРНК^Met _M.

Селеноцистеиновая тРНК (Sec-тРНК): Переносит селеноцистеин в селенопротеины, где селен играет функциональную роль. Кодируется геном tRNA-Sec. Пирролизиновая тРНК (Pyl-тРНК): Переносит пирролизин в метилотрофные археи и некоторые бактерии. Кодируется генами tRNA-Pyl и pilC.

Известны белки, которые только временно, на период трансляции, связываются с рибосомами. К ним относятся: факторы инициации IF-1, IF-2 и IF-3 факторы элонгации EF-Tu и EF-Ts, EF-G факторы «освобождения» RF-1, RF-2 и RF-3

Факторы инициации трансляции (eIF): Участвуют в инициации трансляции, помогая рибосоме связаться с мРНК и стартовым кодоном. Примеры включают eIF2, eIF3 и eIF4. Факторы элонгации трансляции (eEF): Участвуют в элонгации трансляции, способствуя связыванию аминоацил-тРНК с рибосомой и перемещению рибосомы по мРНК. Примеры включают eEF1A, eEF1B и eEF2. Факторы терминации трансляции (RF): Участвуют в терминации трансляции, распознавая стоп-кодоны и прекращая трансляцию. Примерами являются RF1 и RF2. Фактор высвобождения рибосомы (RF3): Способствует высвобождению рибосомы из мРНК и tRNA после трансляции. Полипептидный релизный фактор (РРФ): Альтернативный фактор терминации трансляции, который узнает необычные стоп-кодоны. Рибонуклеаза P: Эндорибонуклеаза, необходимая для обработки предшественников тРНК. Гуанидин-7-метилтрансфераза: Модифицирующий фермент, важный для биогенеза тРНК.