Распознавание репликационного начала:
Комплекс ORC (Origin Recognition Complex) состоит из нескольких белков, включая ORC1, ORC2, ORC3, ORC4, ORC5, ORC6. Этот комплекс связывается с репликационным началом (origin of replication) на ДНК и инициирует активацию других белков репликации.
После связывания ORC, два других белка — Cdc6 и Cdt1 — помогают в загрузке комплекса MCM и других репликационных факторов.
Загрузка геликаз:
Комплекс MCM (Minichromosome Maintenance) представляет собой многокомпонентный белковый комплекс, включающий несколько белков, таких как MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7. Этот комплекс действует как ДНК-геликаза, разрывая водородные связи между основаниями и распаковывая ДНК, образуя репликационную вилку.
Чтобы активировать MCM, требуется еще один комплекс белков, в том числе Cdc45 и GINS (комплекс GINS включает белки Sld5, Psf1, Psf2 и Psf3), которые стабилизируют и активируют MCM.
Синтез рнк-праймера:
Примаза (Primase) синтезирует РНК-праймеры. В эукариотах примаза работает в комплексе с ДНК-полимеразой α (или DNA polymerase α), который совместно с примазой синтезирует начальный фрагмент РНК-праймера.
РНК-праймер нужен для начала синтеза новой цепи ДНК.
Присоединение днк-полимераз:
ДНК-полимераза α выполняет начальный синтез ДНК, но она не обладает высокой процессивностью. После того как начальная цепь ДНК синтезирована, происходит передача синтеза на ДНК-полимеразу δ (или DNA polymerase δ), которая продолжает синтез новой цепи ДНК, работая с высокой процессивностью и точностью.
В некоторых случаях также используется ДНК-полимераза ε для репликации ведущей цепи.
3. Репликация ДНК. Схема репликации ДНК. ДНК-лигазы. Раскручивание двойной спирали ДНК при репликации. ДНК-геликазы, Белки дестабилизирующие спираль. Топологические проблемы раскручивания и репликации ДНК. ДНК-топоизомеразы: топоизомеразы типа I, топоизомеразы типа II, гираза.
Схема репликации ДНК
Кратко:
Топоизомераза режет одну из двух цепей – спираль раскручивается – разрыв сшивается – образуется репликативная вилка (+SSB-белки стабилизируют одноцепочечные нити ДНК) – DnaG синтезирует РНК-праймер – PoI III синтезирует ДНК.
Для отстающей цепи еще: PoI I удаляет РНК праймер и заменяет его ДНК фрагментом (осуществляет ник-трансляцию) – лигаза сшивает разрывы.
Подробно:
1) ДНК-топоизомераза I расщепл. одну цепь ДНК; между Tyr топоизомеразы и PO4- ДНК образуется ковалентная связь;
2) Происходит локальное раскручивание двойной спирали с помощью ДНК-хеликазы;
3) ДНК-топоизомераза I восстанавливает фосфоэфирную связь;
4) Образуется репликативная вилка, в ней SSB-белки (Single-strand binding protein/ Белки дестабилизирующие двойную спираль) стабилизируют одноцепочечные фрагменты ssDNA, предотвращая комплементарное связывание.
События в вилке:
5) ДНК-праймаза DnaG (РНК-полимераза) на ssDNA синтезирует праймер (затравку, короткий фрагмент комплементарной ДНК).
6) Начиная с праймера, ДНК-полимераза III синтезирует лидирующую цепь 5`→3`.
Отстающая цепь синтезируется так же в направлении 5`→3` в виде коротких фрагментов Оказаки:
7) Праймаза DnaG образует комплекс с матричной ДНК и дополнительными белками (DnaB – хеликаза, DnaT, PriA, PriB, PriC).
8) ДНК-полимераза III синтезирует фрагменты Оказаки. У неё нет 5’→3’ экзонуклеазной активности, поэтому она заканчивает синтез перед началом праймера следующего фрагмента.
9) Полимераза I благодаря экзонуклеазной активности удаляет РНК-праймер, и одновременно достраивает предыдущий фрагмент ДНК (благодаря полимеразной активности).
10) 2 соседних фрагмента Оказаки соединяются между собой лигазой.
ДНК-полимераза отстающей цепи движется так же в сторону репликативной вилки, т.к. цепь ДНК, которая служит ей матрицей, образует петлю (180 градусов):
ДНК-лигазы - ферменты, с использованием энергии гидролиза АТФ катализируют ковалентное сшивание цепей ДНК при репликации, репарации и рекомбинации.
Семейства ДНК-лигаз: АТР – зависимые лигазы, NAD – зависимые лигазы.
Механизм действия:
1) Аденилирование: лигаза присоединяет к NH2-концу лизина AMP, отщеплённый от NAD+ или ATP.
2) Трансаденилирование: аденилированная лигаза (лигаза-AMP) перисоединяет AMP к PO4--концу цепи ДНК, содержащей разрыв.
3) Лигирование: OH- группа на одном конце разрыва ДНК образует ковалентную связь с PO4- на другом конце, AMP отщепляется.
ДНК-лигаза I лигирует фрагменты Оказаки при репликации отстающей цепи ДНК и участвует в эксцизионной репарации. В лабораторной работе часто используют ДНК-лигазу бактериофага Т4, она способна соединять как липкие, так и тупые концы ДНК, а так же сшивать ники – разрывы в двух цепях.
ДНК-геликазы — класс ферментов, которые разрывают водородные связи между основаниями в dsDNA (с использованием энергии гидролиза ATP, GTP), разделяют две цепи dsDNA. Некоторые могут двигаться в направлении 3' → 5', другие – в направлении 5' → 3'.
Белки дестабилизирующие спираль (Single-strand binding protein, SSB-белки) — связывают одноцепочечные фрагменты ДНК, и предотвращают комплементарное связывание в двойную спираль.
Топологические проблемы раскручивания и репликации ДНК
Теоретически, при расплетании dsDNA должны либо образовываться очень плотные сверхвитки по обе стороны от репликативного глазка, либо материнская ДНК должна вращаться вокруг своей оси. Но оба этих процесса в условиях клетки механически затруднены. Для релаксации – раскручивания сверхвитков, которые будут образовываться при расплетании dsDNA – ферменты ДНК-топоизомеразы вносят в ДНК одно- или двухцепочечный разрыв.
ДНК-топоизомеразы - ферменты, осуществляют топологические изменения, снятие сверхвитков. Механизм: разрыв одной или двух цепей → поворот → сшивание.
Топоизомеразы типа I - наиболее распространены, участвуют в репликации, сбрасывают сверхспирализацию, возникающую при быстром расплетании dsДНК. Топоиз.I разрезает одну из цепей и ковалентно связывает фосфат 5`-конца разрыва ДНК своим тирозином → дуплекс свободно вращается (и релаксирует) → фосфодиэфирная связь восстанавливается.
Топоизомеразы типа II – разрывают двойную спираль для релаксации сверхвитков в кольцевой ДНК. 1-ая dsДНК входит в фермент → закрепляется в центре фермента → 2-ая dsДНК заходит в фермент перпендикулярно (связывание АТФ) → конформац.изменения фермента → фермент разрывает 1-ю dsДНК → 2-ая dsДНК проходит через разрыв и выходит с другой стороны фермента, когда он открывается (связывание АТФ) → 2-ая ds ДНК сшивается. В результате число сверхвитков изменяется на 2. Сам процесс работает за счёт энергии теплового движения, энергия АТФ тратится на то, чтобы сделать его необратимым!
У прокариот есть специальная топоизомераза типа II – ДНК-гираза – она разрезает dsДНК под «+»-сверхвитком и сшивает цепи над ним, формирует «-»-сверхспирализацию. На ДНК-гиразу влияют некоторые классы антибиотиков («-» сверхспирализ. исчезает и бактерия не размножается).