13. Регуляция экспрессии лактозного оперона.
Гены белков, функции которых в метаболических процессах тесно связаны, часто в геноме группируются вместе в структурные единицы (опероны). Оперон – группа прокариотических генов, которые расположены друг за другом, находятся под управлением одного промотора и транскрибируются с образованием полицистронного транскрипта одной мРНК, кодирующей несколько белков.
Лактозный оперон кодирует последовательности нескольких функционально связанных белков, участвующих в усвоении лактозы (в клетке лактоза расщепляется на глюкозу и галактозу). Три структурных гена lacZ, lacY и lacA кодируют, соответственно, β-галактозидазу (катализирует расщепление в-галактозидной связи), β-галактозидпермеазу (осуществляет трансмембранный перенос низкомолекулярных веществ, в том числе лактозы) и β-галактозидтрансацетилазу (ацетилирует галактозу). Перед этими генами находится промотор, который обеспечивает синтез полицистронного транскрипта, кодирующего все три белка.
Негативная регуляция:
Негативная регуляция инициации транскрипции, или репрессия, осуществляется белками репрессорами, которые связываются с операторами. Со стороны промотора lacP к оперону примыкает регуляторный ген lacI, который кодирует белок-репрессор, связывающий специфический участок вблизи промотора – оператор – в отсутствии лактозы. Репрессор связывается с оператором в форме тетрамера (из 4 субъединиц). Частично область оператора перекрывается с промотором lacP, поэтому наличие репрессора на операторе не дает возможности РНК-полимеразе связаться с промотором и индуцировать транскрипцию.
При наличии индуктора (лактозы) в клетке происходит его связывание с белком-репрессором. Это приводит к изменению конфигурации молекулы репрессора, эта модифицированная форма теряет сродство к операторному участку. Связываться с оператором репрессор не может, репрессия снимается. Транскрипция генов лактозного оперона становится возможной, оперон активирован. При снижении концентрации лактозы в клетке, новые порции белка-репрессора связываются с оператором и блокируют синтез ферментов.
Позитивная регуляция:
Позитивная регуляция может осуществляться при связывании специфических белков-активаторов с нуклеотидными последовательностями, расположенными в области промотора. Если в клетке концентрация глюкозы достаточно высока для поддержания метаболизма, активация лактозного оперона не происходит, так как отсутствия белка-репрессора недостаточно для начала транскрипции. Однако, если концентрация глюкозы снижается, происходит активация фермента аденилатциклазы, которая катализирует превращение АТФ в циклическую форму – цАМФ (cAMP). Происходит связывание цАМФ с белком-активатором катаболизма CAP (или CRP – белок-рецептор цАМФ) и образуется комплекс сAMP-CAP, взаимодействующий с промотором лактозного оперона и изменяющим его конформацию, что приводит к увеличению сродства РНК-полимеразы к промотору. Происходит экспрессия генов.
14. Регуляция экспрессии триптофанового оперона.
Триптофановый оперон кодирует 5 ферментов (trpА, trpB, trpC, trpD, trpЕ), которые отвечают за синтез триптофана из хоризмовой кислоты. Кроме этих 5 генов в опероне есть ген trpL, кодирующий лидерную мРНК.
По мере увеличения концентрации триптофана наступает момент, когда его дальнейший синтез становится нежелательным и транскрипция прекращается. При наличии в среде достаточного для роста бактерий количества триптофана клетки Е. coli образуют ферменты биосинтеза триптофана в очень малых количествах. Однако если клетки лишены экзогенного триптофана, то в них начинается интенсивный синтез всех пяти ферментов.
Механизмы регуляции:
1) Основан на репрессии, изменяющей эффективность инициации транскрипции в промоторе.
Транскрипция trp-оперона блокируется, когда репрессор связывается с последовательностью trp-оператора. Ген trp R, кодирующий репрессорный белок, находится далеко от trp-оперона. Для того чтобы trp R-белок мог связаться с оператором и действовать как репрессор, он должен образовать комплекс с триптофаном. Поскольку уровень экспрессии trpR очень низок и не зависит от триптофана, концентрация активного репрессора отражает концентрацию внутриклеточного триптофана.
Нуклеотидные последовательности trp-оператора и промотора перекрываются, поэтому связывание комплекса репрессор-триптофан с оператором препятствует правильному взаимодействию РНК-полимеразы с промотором. При этих условиях транскрипция оперона не осуществляется и ферменты биосинтеза не образуются. В отсутствие триптофана не происходит и связывания репрессора с оператором, что позволяет РНК-полимеразе без помех инициировать транскрипцию на промоторе и синтезировать мРНК.
2) Аттенуация экспрессии триптофанового оперона
Во время транскрипции синтезируется полицистронная мРНК. Лидерная мРНК содержит участки, комплементарные друг другу (1 комплементарен 2, 3 комплементарен 4, 2 комплементарен 3). Комплементарные участки могут образовывать шпильки.
Шпилька 3-4 терминаторная, она прекращает транскрипцию по механизму Rho-независимой терминации: шпилька взаимодействует с РНК-полимеразой, вытесняя ее с матрицы ДНК. В этом случае образуется лидерная мРНК (не образуется весь транскрипт).
Транскрипция и трансляция у прокариот сопряжены, на транскрибируемую мРНК сразу садится рибосома и начинает синтез белка.
В участке 1 есть два расположенных подряд кодона, которые кодируют триптофан. Если триптофана в клетке много рибосома движется достаточно быстро. Когда РНК-полимераза транскрибирует участок 3-4, рибосома находится в таком положении, что участок 2 не может взаимодействовать с участком 3. Участки 3, 4 образуют шпильку, терминаторная шпилька ингибирует синтез РНК-полимеразой транскриптов. То есть, когда триптофана много, РНК-полимераза останавливает синтез мРНК.
Если в клетке триптофана мало, идет транскрипция оперона. Рибосома останавливается (подвисает) на двух кодонах, кодирующих триптофан. (Концентрация триптофана низкая, время прихода тРНК с триптофаном относительно большое, несколько кодонов, кодирующих триптофан, подряд – задержка больше.) Рибосома тормозит на 1 участке. Когда участок 3 будет транскрибирован, участок 2 оказывается свободным и формируется шпилька 2-3, которая не является терминатором. 4 участок не образует шпильку с 3 – аттенуирующий сигнал не формируется. Транскрипция идет дальше, образуется полная мРНК.
