2. БИОСИНТЕЗ БАКТЕРИЙ В ФЕРМЕНТЕРЕ BIOFLO (7,5 л.)

2.1. Подготовка сырья, материалов и оборудования к биосинтезу бактерий Cupriavidus eutrophus В10646

Перечень сырья и материалов, необходимый для проведения биосинтеза:

-стеклянная воронка d-100мм - 2 шт.;

-банка с крышкой для подпиток (1 л.) - 5 шт. (Рис. 1);

-банка с крышкой для подпиток (0,5 л.) - 1 шт.;

-шланги для малолитражных ферментёров – 3 шт.;

-колба КН-1-500 (колба на 0,5 л. с притертым горлышком) – 3 шт.;

-колба КН-1-2000 (колба на 2 л. с притертым горлышком) – 3 шт.;

-колба мерная на 2 л – 1 шт.;

-колба мерная на 250 мл – 1 шт. (при культивировании на фруктозе);

-колба мерная на 100 мл – 1 шт.;

-пробирка – 10 шт.;

-шприцы стерильные на 5-10 мл. - 2 шт.;

-фильтр стерилизующий Millipor (для стерилизации глюкозы) со шлангом - 1 шт. (Рис.3);

-фильтр воздушный PTFE 0.2 µm Acro ø73 mm – 2 шт;

-фильтр воздушный PTFE 0.2 µm Thermo ø 30 mm – 6 шт;

-раствор глюкозы (500 г/л) или фруктозы (350 г/л) - 2,5 л;

-раствор мочевины (60 г/л) - 1,5 л;

-раствор микроэлементов - 300 мл;

-мерный цилиндр на 0,25 л - 2 шт.;

-мерный цилиндр на 0,1 л - 2 шт.;

-мерный цилиндр на 0,025 л – 1 шт.;

-ферментно-хромогенная смесь - 300 мл (при культивировании на глюкозе);

-раствор MgSO4 - 250 мл;

-резорцин + спирт - 150 мл (при культивировании на фруктозе);

-раствор соляной кислоты - 300 мл (при культивировании на фруктозе);

-масло подсолнечное в мерной колбе на 100 мл. - 50 мл.

13

Рис.1 – Банка для подпиток, емкость 0,5/1 л в оснащенном состоянии (1-банка, 2- крышка, 3-воздушный фильтр, закрытый фольгой, 4-штуцер, закрытый фольгой/ надетым шлангом, 5-шланг для малолитражных ферментеров, закрытый фольгой)

Помывка материалов и оборудования

Перед использованием посуду и инвентарь необходимо тщательно вымыть, используя в основе мыльный раствор хозяйственного мыла.

Помывка посуды (воронки, колбы, цилиндры, банки, пробирки):

-с посуды стереть все имеющиеся надписи;

-губкой с мыльным раствором обработать внутреннюю и внешнюю часть посуды до полного удаления загрязнений. При мытье пробирок и мерных цилиндров использовать ёршик;

-прополоскать водой из-под крана до удаления мыльного раствора;

-прополоскать дистиллированной водой.

Помывка шлангов:

-губкой с мыльным раствором помыть внешнюю сторону шланга;

-промыть внутреннюю часть шланга проточной водой (5-10 минут);

-промыть внутреннюю часть шланга мыльным раствором;

-прополоскать внутреннюю часть шланга водой из-под крана;

-прополоскать внутреннюю часть шланга дистиллированной водой. Помывка и подготовка ламинарного шкафа:

-помыть шкаф губкой с мыльным раствором с добавлением обеззараживающего средства «Аламинол» (колпачок на 5 л. воды или мыльного раствора);

-промыть шкаф губкой с чистой водой;

-вытереть шкаф насухо чистыми салфетками или тряпкой;

-включить в шкафу УФ-лампу на 15-20 мин;

-через 15 мин после выключения УФ-лампы шкаф готов к работе.

14

Стерилизация посуды и инвентаря

Стерилизация посуды и инвентаря производится в автоклаве MLS 3781L. Для этого необходимо:

-банки для подпиток (0,5/1 л) закрыть крышками (рис.1). Для выбора нужной крышки нужно учитывать, чтобы шланг для откачки субстрата доставал до дна банки. К выходу для откачки подпитки присоединить шланг или же выход закрыть фольгой. Конец шланга, что остался свободным, обернуть фольгой. На воздушный выход крышки присоединить воздушный фильтр PTFE 0.2 μm (широким носиком фильтра или же надписью на фильтре от банки) и обернуть фольгой. Банки стерилизовать в автоклаве при 1 атм., 121 ˚С, 30 мин. ПРИМЕЧАНИЕ:

Банки для подпиток автоклавировать в приоткрытом состоянии. После стерилизации, перед извлечением из автоклава, крышки банок необходимо плотно закрыть;

-стеклянную воронку поместить в мешок, завязать и стерилизовать в автоклаве при 1 атм., 121 ˚С, 30 мин;

-шланги для малолитражных ферментеров поместить в мешок, завязать и стерилизовать в автоклаве при 1 атм., 121 ˚С, 30 мин;

-шприцы с надетой иглой, и колпачком поместить в мешок. Мешок подвязать и стерилизовать в автоклаве при 1 атм., 121 ˚С, 30 мин. После стерилизации шприцы хранить в ламинарном шкафу;

-фильтр стерилизующий Millipor вместе со шлангом стерилизовать в завязанном мешке, в автоклаве при 1 атм., 121 ˚С, 30 мин.;

-мерные цилиндры закрыть ватно-марлевой пробкой и обернуть бумагой, бумагу подвязать верёвкой и далее стерилизовать в автоклаве при

1 атм., 121˚С, 30 минут.

После стерилизации, стерильную посуду и инвентарь нужно хранить в ламинарном шкафу в стерильных условиях.

Приготовление питательных растворов, пеногасителя

Приготовление стерильного раствора мочевины с добавкой MgSO4

Стерильный раствор мочевины готовится из расчёта 60 г/л, для этого необходимо:

-засыпать 60 г мочевины/карбамида (CH4N2O) в мерный стакан и долить дистиллированной водой до метки в 0,5 л;

-после полного растворения, залить дистиллированной водой до метки 1 л и перелить раствор в колбу КН-1-2000 (заливать не более

15

половина объёма ёмкости), далее закрыть ватно-марлевой пробкой и обернуть бумагой, бумагу подвязать верёвкой;

- стерилизовать мочевину в автоклаве при 0,5 атм., 115 °С, 25 мин. Стерильный раствор MgSO4 готовится из расчёта 45 г/л, для этого

необходимо:

-засыпать 11,25 г сернокислого (сульфата) магния (MgSO4) в мерный стакан и долить дистиллированной водой до метки в 0,1 л;

-после полного растворения, долить до метки 0,25 и перелить раствор в колбу КН-1-500, закрыть ватно-марлевой пробкой и обернуть бумагой, бумагу подвязать верёвкой;

-стерилизовать в автоклаве при 1 атм., 121 °С, 30 мин.

Стерильный раствор мочевины с добавкой MgSO4 готовится из расчета 100 мл MgSO4 на 1 литр мочевины, для этого необходимо в ламинарном шкафу в стерильных условиях (под пламенем спиртовки):

-перелить мочевину в стерильную банку для подпиток;

-влить в мерный цилиндр 100 мл MgSO4, затем перелить в банку с мочевиной, при необходимости надеть на штуцер банки стерильный шланг для малолитражных ферментеров.

Приготовление стерильного раствора глюкозы

Раствор глюкозы готовить из расчёта 500 г/л. Для растворения глюкозы используют плитку электрическую с магнитным перемешиванием MR Hei-Standart Heidolph с температурой нагрева 60˚С. В колбу на 2 литра (с риской) заливают 1 л. дистиллированной воды. Затем в колбу опускают магнит, ставят на плитку и засыпают 1 кг глюкозы. После полного растворения глюкозы (около 2-х часов), в колбу добавляют дистиллированную воду до риски. Колбу закрывают фольгой, во избежание испарения воды.

Стерилизация и розлив в банки для подпиток приготовленного раствора глюкозы производится с использованием перистальтического насоса (рис. 2), шланга, стерилизующего фильтра Millipor (рис. 3) и ламинарного шкафа для создания асептических условий.

16

Рис 2. – Перистальтический насос ISM 1020A (1-тумблер включения, 2-табло скорости подачи, 3-индикаторы направления подачи, 4-прижимная планка, 5-кнопка максимальной скорости подачи, 6-кнопки регулировки скорости подачи, 7-кнопка включения/выключения подачи, 8-кнопка переключения направления подачи, 9-рычаг прижимной планки)

Рис 3. – Фильтр стерилизующий Express SHC Millipore (1-вход, 2-нижний клапан, 3-верхний клапан, 4-выход, 5-шланг)

Для получения стерильного раствора глюкозы необходимо:

-подготовить ламинарный шкаф к работе;

-поместить в ламинарный шкаф стерильные тряпочные мешки со стерилизующим фильтром (в сборе со шлангом), шлангами для малолитражных ферментёров, стерильные банки для подпиток, заглушки, спирт, вату и емкость для прокачки системы (стакан 100-200 мл);

17

-извлечь и закрепить на стенке ламинарного шкафа стерилизующий фильтр, после чего шланг 5 (рис. 3) стерильно (с помощью ваты, смоченной спиртом) присоединить к подаче 4 банки для подпиток (рис. 1);

-вставить шланг для перекачки 4 (рис. 4) утолщением в перистальтический насос и прижать прижимной планкой 4 с помощью рычага 9 (рис. 2);

-опустить один конец шланга для перекачки в емкость с приготовленным раствором глюкозы, другой конец – присоединить к входу 1 стерилизующего фильтра (рис. 3);

-открыть нижний клапан 2 стерилизующего фильтра, проверить, чтобы верхний клапан 3 был закрыт (рис. 3);

-включить перистальтический насос поворотом тумблера 1, убедится, что индикатор 3 показывает правильное направление подачи (при необходимости изменить кнопкой 8). Затем, с помощью кнопок 6 выбрать скорость подачи на табло равную 5 и включить подачу кнопкой 7 (рис. 2);

-прекратить подачу раствора глюкозы и закрыть нижний клапан стерилизующего фильтра, когда шланг для перекачки заполнится раствором, весь воздух выйдет, и через нижний клапан 2 стерилизующего фильтра (рис. 3) нормализуется стабильный поток раствора. Сбор раствора глюкозы необходимо осуществлять в емкость;

-открыть верхний клапан 3 стерилизующего фильтра (рис. 3), включить перистальтический насос, дождаться пока через верхний клапан нормализуется стабильный поток раствора. Сбор раствора глюкозы необходимо осуществлять в емкость;

-закрыть верхний клапан стерилизующего фильтра, после чего визуально убедиться, что стерильный раствор глюкозы поступает в банку для подпиток.

После заполнения банки для подпиток, подачу перистальтического насоса необходимо остановить, затем стерильно произвести замену банки для дальнейшего наполнения. После заполнения, к одной из банок необходимо стерильно зацепить шланг для малолитражных ферментеров, на следующие заполненные банки стерильно установить заглушки.

Для предварительной помывки шланга для перекачки и стерилизующего фильтра, необходимо вместо емкости с исходным раствором установить емкость 5-10 л с очищенной водой, а вместо банки для подпиток установить пустую емкость 5-10 л и несколько раз промыть

18

систему, каждый раз заменяя воду. При промывке системы рекомендуется использовать скорость перистальтического насоса равную 10. По окончании предварительной промывки, необходимо выключить насос тумблером 1 (рис. 2) и разобрать систему стерилизации в обратном порядке.

Рис 4. – Схема стерилизации раствора глюкозы (1-фильтр стерилизующий, 2- банка для подпиток 0,5/1 л, 3-насос перистальтический, 4-шланг для перекачки, 5- емкость с исходным раствором глюкозы)

Приготовление стерильного пеногасителя

В качестве пеногасителя в процессе культивировании используется подсолнечное масло. Для приготовления стерильного пеногасителя необходимо подсолнечное масло (примерно 50 мл) залить в колбу мерную на 100 мл, закрыть ватно-марлевой пробкой и обернуть бумагой, бумагу подвязать верёвкой. Стерилизовать в автоклаве при 1 атм., 121 °С, 30 мин.

Приготовление фосфатного буфера

Для приготовления фосфатного буфера (неполной среды Шлегеля) необходимо на 1 л дистиллированной воды добавить 9 г Na2HPO4 и 1.5 г

KH2PO4. Фосфатный буфер стерилизуется вместе с ферментером.

19

Приготовление раствора железа (III) лимоннокислого

Для приготовления раствора железа (III) лимоннокислого необходимо на 200 мл дистиллированной воды добавить 1 г лимоннокислого железа, затем кипятить на плитке до полного растворения (не более 1 ч), далее перелить в колбу КН-1-500, закрыть ватно-марлевой пробкой и обернуть бумагой, бумагу подвязать верёвкой, далее стерилизовать при 1 атм., 121 °С, 30 мин. Хранить в холодильнике.

Приготовление раствора микроэлементов

Для приготовления раствора микроэлементов необходимо в колбу КН-1-2000 внести поочередно навески солей (таблица 4), довести до метки дистиллированной водой и перемешать до полного растворения, стерилизовать при 1 атм., 121 °С, 30 мин. Хранить в холодильнике.

Таблица 4 - Навески солей для приготовления раствора микроэлементов

Приготовление аналитических растворов

Для приготовления ферментно-хромогенной смеси (для определения глюкозы) необходимо использовать набор «Глюкоза - ФКД». При приготовлении руководствоваться вложенной инструкцией в части «Приготовление рабочего раствора». Использовать колбу на 500 мл обёрнутой фольгой (для предотвращения попадания света) с крышкой. Смесь готова после полного растворения таблеток. Хранить готовую смесь в холодильнике.

Для приготовления раствора соляной кислоты (для измерения фруктозы) необходимо в КН-1-500 залить 50 мл дистиллированной воды и добавить 250 мл концентрированной соляной кислоты. Примечание: Не лей воду в кислоту!

20