3.1.8 Ингибиторы образования пластохинона
В клетках животных и растений 4-гидроксифенилпируват-диоксигеназа участвует в катаболизме фенилаланина и тирозина, превращая образующийся из тирозина в результате дезаминирования трансаминазами 4-гидроксифенилпируват в гомогентизиновую кислоту. В растительных клетках гомогентизиновая кислота алкилируется полипренилпирофосфатами с числом изопентенильных структурных элементов 9 или 10 и декарбоксилируется, превращаясь в исходное соединение для синтеза пластохинона:
Образовавшийся в результате этого превращения гидрохинон метилируется и дегидрируется, превращаясь в пластохинон:
Роль пластохинона не ограничивается участием в электронпереносящей цепи фотосистемы II. Пластохинон является также кофактором в биосинтезе каротиноидов. В соответствии с этим ингибирование 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназы и других участвующих в биосинтезе пластохинона ферментов приводит к обесцвечиванию листьев растений на свету из-за того, что прекращается биосинтез каротиноидов, гасящих триплетные состояния хлорфила и синглетное состояние кислорода. Блокирующие биосинтез пластохинона ацилзамещенные циклогексан-1,3-дионы используются в качестве гербицидов с системным и почвенным действием. Одно из действующих веществ этого класса Мезотрион получают ацилированием циклогексан-1,3-диона хлорангидридом 4-метилсульфонил-2-нитробензойной кислоты в присутствии оснований:
В соответствии с правилом ЖМКО в молекуле циклогександиона ацилирование протекает по атому кислорода с образованием производного О-ацильного производного енольной формы. Его изомеризация в 2‑ацилированный индандион протекает в присутствии цианидного иона, образующегося из ацетонциангидрина:
Мезотрион и его структурные аналоги используют в качестве избирательных гербицидов в посевах кукурузы; его медианная токсичность для теплокровных (˃5000мг/кг) позволяет относить его к третьему классу опасности.
Биосинтез пластохинона блокирует также изоксафлютол. Во влажной почве он превращается в дикетонитрил, который и является носителем гербицидной активности:
Изоксафлютол, как и мезотрион, используется в посевах кукурузы.
3.1.9 Гербицидные фосфорорганические ингибиторы метаболических превращений
При поиске антиметаболитов в обменных процессах с участием карбоновых кислот и фосфатов важное место занимают исследования биологической активности органических производных кислот фосфора. В основе этого подхода лежит структурное подобие фосфатной и фосфонатных функциональных групп, а также карбоксилатной и фосфинатных групп:
,
Ферментативные превращения метаболитов с фосфатными функциональными группами протекают с разрывом эфирной связи между органическим остатком и остатком фосфорной кислоты, тогда как РС-связь в фосфонатах чаще всего стабильна. Кроме того, фосфатная и фосфинатная функциональные группы отличаются от карбоксилатной более высокой комплексообразующей способностью из-за высокой полярности фосфорильной группы. Определённую роль в антиметаболитном связывании с активными центрами ферментов играет также фиксированная тетракоординированная структура фосфонатов и фосфинатов, соответствующая переходному состоянию в реакциях органических соединений с участием карбонильной группы.
В соответствии с этим, например, не удалось обнаружить перспективную биологическую активность у α-аминофосфоновых кислот, которые могли быть аналогами белковых аминокислот. Это объясняется тем, что в антиметаболите фосфонатная группа может альтернативой фосфатной, а не карбоксилатной группе. В то же время 2-амино-4-(метилгидроксифосфорил)масляная кислота оказалась антиметаболитом глютаминовой кислоты в её превращении в глютамин при катализе глютаминсинтетазой:
В этом случае в основе биологической активности 2-амино-4-(метилгидроксифосфорил)масляной кислоты лежит высокая прочность РО‑связи, замещение которой на PN-связь с участием АТФ невозможно.
Ещё в двадцатые годы ХХ столетия были синтезированы многие производные фосфонмуравьиной кислоты и лишь более полувека спустя было обнаружено, что её эфиры и амиды обладают хорошей рострегуляторной и арборицидной активностью (арборициды – это средства борьбы с древесно-кустарниковой растительностью). Арборицидный эффект используется для уничтожения древесно-кустарниковой растительности под линиями электропередач, перед взлетно-посадочными полосами аэродромов и в полосах отчуждения около железных дорог. Основным препаратом в этой группе производных кислот фосфора стал Кренайт (фосамин) – аммонийная соль моноэтилового эфира карбамоилфосфоновой кислоты:
Токсичность у этого вещества настолько низка, что она даже не определяется. При обработке кустарников и деревьев содержащими это вещество водными растворами за несколько недель до листопада многолетние растения не показывают никаких внешних изменений и сбрасывают пожелтевшую листву, как и необработанные. Однако выход из состояния покоя весной прошедших обработку фосамином растений задерживается, раскрывшиеся почки не идут в рост и растения в конце концов погибают. При этом трава и другие однолетние растения никак не поражаются.
Для синтеза фосамина используется достаточно простая схема. Сначала из триэтилфосфита и метилхлорформиата по реакции Арбузова получают метиловый эфир диэтоксифосфорилмуравьиной кислоты, карбоксилатная группа которого реагирует с концентрированным водным аммиаком с образованием амида, а одна из эфирных групп у атома фосфора гидролизуется:
Карбамоилфосфонат представляет собой структурный аналог карбамоилфосфата, принимающего участие в биосинтезе пиримидиновых оснований, которые нужны для построения рибонуклеиновых кислот. В соответствии с этим можно было предположить, что фосамин является антиметаболитом карбамоилфосфата и его арборицидный эффект основан на ингибировании трансферазы, катализирующей перенос карбамоильной группы на аспарагиновую кислоту с образованием N‑карбамоиласпарагиновой кислоты. Однако более вероятно, что фитоактивность фосамина основана на ингибировании металлопротеиназ в активном центре которых находится ион цинка. Карбамоилфосфонаты действительно представляют собой неизбирательные ингибиторы цинковых гидролаз из-за образования ими прочного комплекса в активном центре фермента с участием иона цинка:
Как отмечалось выше, арборицидный эффект фосамина проявляется при обработке деревьев и кустарников осенью за несколько недель до начала активного сбрасывания ими листьев. Листопад представляет собой последнюю фазу естественного процесса старения в листве многолетних растений. Он включает строгую последовательность метаболических превращений, которые позволяют растению извлечь содержащиеся в листьях белки, углеводы и другие нужные вещества и сбросить выполнившую свою функцию листву, из которой растение забрало всё, что может ему ещё понадобиться при выходе из состояния покоя. Это означает, что осенний листопад вовсе не является вызванным неблагоприятными климатическими условиями сочетанием не связанных между собой разрушительных процессов. Заканчивающийся листопадом этап в жизни многолетних растений – это четко организованная и хорошо контролируемая последовательность катаболических превращений в клетках листьев. Заблокировав металлопротеиназы, катализирующие гидролитическое разложение белков на растворимые и легко мигрирующие аминокислоты и пептиды, можно лишить растение возможности извлечения из опадающей листвы исходных продуктов для построения белков, которые потребуются ему весной. Недостаток этих веществ при весеннем пробуждении может быть основной причиной гибели обработанных фосамином многолетних растений. Понятно, что на однолетних растениях, которые весной прорастают из семян, блокировка металлопротеиназ не оказывает никакого эффекта.
Лежащая в основе фосамина фосфонмуравьиная кислота и её гомолог фосфонуксусная кислота представляют собой антиметаболиты пирофосфорной кислоты, принимающей участие в биосинтезе нуклеиновых кислот, катализируемом ДНК полимеразой. Сама фосфонмуравьиная кислота неустойчива. Она легко декарбоксилируется с образованием фосфористой кислоты и диоксида углерода, но её натриевая соль (фоскарнет) – это стабильное соединение, которое используется в качестве лекарственного средства. Фоскарнет, конечно, нельзя принимать через рот, так как в желудке соляная кислота переводит его в декарбоксилирующуюся кислоту, но в виде мазей или инъекций фоскарнет представляет собой эффективное средство для лечения герпесных и цитомегаловирусных инфекций.
Гомолог фосфонмуравьиной кислоты – фосфонуксусная кислота – стабильна. В опытах in vitro она также является хорошим противовирусным и даже противораковым средством, но лекарственные препараты на её основе неизвестны.
Мишенью фитотоксического действия гербицидов могут быть и ферментные системы, участвующие в биосинтезе общих для всего живого аминокислот. В гетеротрофных организмах, получающих белки в составе пищевых продуктов, отсутствуют ферменты, предназначенные для биосинтеза так называемых незаменимых кислот. В соответствии с этим блокирование участвующих в их образовании ферментных систем не должно нарушать обменные процессы в организмах животных. Так, например, антиметаболитный подход был использован в опытах по получению соединений, ингибирующих биосинтез аминокислоты гистидина. Однако полученные в ходе этого исследования триазольные и фосфорорганические структурные аналоги промежуточных продуктов биосинтеза гистидина оказались или малоактивными, или же труднодоступными, а 3-аминотриазол, один из механизмов фитотоксичности которого основан на блокировке биосинтеза гистидина, оказался канцерогеном.
В растениях имеется ферментная система, синтезирующая незаменимые аминокислоты фенилаланин, триптофан и тирозин. Ключевым этапом в образовании этих аминокислот является взаимодействие 3-фосфошикимовой кислоты с фосфоенолпируватом с образованием хоризмовой кислоты (триптофан образуется из неё через антраниловую кислоту):
Для образования фенилаланина хоризмовая кислота превращается в префеновую кислоту в результате миграции образовавшегося из фосфоенолпирувата трёхуглеродного структурного элемента в п‑положение по отношению к гидроксильной группе:
В виде солей эта дикарбоновая кислота устойчива, но в кислой среде она дегидратируется и декарбоксилируется с образованием фенилпировиноградной кислоты, которая соответствующей трансаминазой превращается в фенилаланин.
На стадии образования хоризмовой кислоты эта цепочка превращений блокируется фосфонометилглицином:
Некоторое время считалось, что это вещество, очень похожее на фосфоенолпируват, является его антиметаболитом в реакции с 3‑фосфошикимовой кислотой. Интересно, что это взаимодействие представляет собой единственное известное в биохимии превращение, в котором фосфоенолпируват участвует в протонированном по атому кислорода виде, а у фосфонометилглицина атом азота в нейтральных средах всегда протонирован. И всё же более детальные исследования показали, что глифосат связывается не в активном центре, а в каком-то регуляторном центре фермента, то есть речь здесь не идёт о конкурентном ингибировании и в соответствии с этим фософонометилглицин не может рассматриваться как антиметаболит фосфоенолпирувата в биосинтезе хоризмовой кислоты.
Гербицидная активность фосфонометилглицина была обнаружена при проведении комплекса исследований, требуемых для регистрации нового регулятора роста растений – Поляриса, представляющего собой образующийся по реакции Кабачника–Филдса из фосфористой кислоты, формальдегида и глицина N,N‑бис(фосфонометил)глицин с тривиальным названием глифосин:
В обработанных глифосином растениях сахарного тростника происходит отток углеводных составляющих из листьев в стебли, что повышает выход сахара на 10-15 %. По существующим требованиям к безопасности агрохимических препаратов биологическая активность претендующего на практическое использование средства воздействия на живую природу должна быть исследована не только у самого регистрируемого препарата, но и у его возможных метаболитов. Одним из таких продуктов биотрансформации бис(фосфонометил)глицина мог быть фосфонометилглицин. Его синтезировали и обнаружили у него высокую гербицидную активность (компания Монсанто). Под тривиальным названием глифосат, это вещество в составе препаративной формы Раундап стало первым гербицидом с объёмом продаж более 1 млрд. долл. США в год. В 1998 г. его производство превысило 100000 т/год, а объём продаж превысил 2 млрд. $ США. Это вещество имеет ЛД50 около 4900 мг/кг, а его метаболизм ни на одной из стадий не приводит к образованию более токсичных продуктов.
Блокирующий образование трёх белковых аминокислот глифосат представляет собой гербицид сплошного действия, однако оказалось, что почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens, вызывающая у растений образование аналогичных опухолям галлов, переносит в их геном свой ген 5-енолпируватшикимат-З-фосфатсинтазы (EPSPS), кодирующий учтойчивый к действию глифосата фермент. В результате такой естественной трансфекции были получены устойчивые к глифосату генетически модифицированные сорта кукурузы. Технология выращивания таких культур значительно упрощается, что привело к резкому росту спроса на содержащие фосфонометилглицин гербицидные составы и на генетически модифицированные сорта кукурузы. Этот же механизм изменения генетического аппарата клеток растений может лежать в основе появления устойчивых к глифосату сорных растений. Для борьбы с сорняками в посевах кукурузы компания DOW разработала комплексный гербицидный препарат Enlist, включающий в качестве действующих веществ 2,4‑дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) и глифосат.
Первый реализованный в промышленном масштабе способ получения фосфонометилглицина был представлен реакцией конденсации N‑замещенных глицинов (заместитель Х) с диэфирами фосфористой кислоты и формальдегидом:
При кипячении с сильными кислотами полученные продукты конденсации отщепляют эфирные группы и защитную группу Х в тех случаях, когда Х легко образует карбокатион (бензильная, бензгидрильная, третбутильная и другие группы). Были разработаны и запатентованы и другие способы получения глифосата.
В настоящее время в производстве глифосата используют в основном последовательность превращений, начинающихся с диэтаноламина. Его дегидрируют в присутствии гидроксида натрия на катализаторе из меди Ренея (скелетная металлическая медь, получаемая выщелачиванием алюминия из его сплава с медью). К полученному в реакции дегидрирования раствору натриевой соли иминодиуксусной кислоты осторожно прибавляют трихлорид фосфора. При этом идёт его гидролиз до фосфористой кислоты и нейтрализация реакционной массы образующимся хлористым водородом. После этого прибавляют водный раствор формальдегида и по реакции Кабачника–Филдса получают фосфонометилиминодиуксусную кислоту:
Фосфонометилиминодиуксусную кислоту окисляют пероксидом водорода в присутствии вольфрамата или молибдата аммония до соответствующего N‑оксида и разлагают его сульфатом железа(II):
Поиск более экологичных способов получения глифосата из фосфонометилиминодиуксусной кислоты завершился разработкой катализируемого активированным углем отщепления одной из карбоксиметильных групп кислородом в качестве окислителя в соответствии со схемой:
При пропускании воздуха с небольшим избыточным давлением в раствор фосфонометилиминодиуксусной кислоты с диспергированным в воде активированным углем при повышенной температуре с высокой избирательностью идёт избирательное окисление только одной карбоксиметильной группы. Так, например, порошкообразный древесный активированный уголь марки Nuchar RGC позволяет проводить это превращение с выходом по глифосату 98,9 % при конверсии по исходному соединению 99 %. При этом селективность по продукту дальнейшего окисления глифосата аминометилфосфонату составляет 0,3 %.
В настоящее время срок действия патента на фосфонометилглицин как активное начало гербицидов закончился, и на рынок поступают препараты многих компаний под названиями Раттлер, Рэйнджер, Родео и др., содержащие это активное вещество. Широкие масштабы использования глифосата требуют очень тщательного изучения возможных последствий воздействия на человека и окружающую среду даже минимальных доз этого вещества. Такие исследования были проведены Европейским Союзом и на их основании глифосат был признан абсолютно безопасным агрохимическим препаратом. Тем не менее есть данные о росте числа раковых заболеваний в областях, где он применяется в течение многих лет. Это может быть связано с образованием N‑нитрозопрозводного глифосата в почве с азотными удобрениями или же с примесью в технических партиях гидроксиламинного производного глифосата (с фрагментом ‑NOH-), образующегося при разложении N‑оксида фосфонометилиминодиуксусной кислоты. Мутагенный эффект может быть связан и с присутствием остаточных количеств солей вольфрамовой или молибденовой кислоты в гербицидных препаративных формах. При этом следует отметить, что в течение многих лет в продажу поступали дешёвые гербицидные составы, полученные из содержащих до 10 % глифосата маточных растворов, остающихся после выделения чистого глифосата. Понятно, что содержание в них тяжелых металлов и побочных продуктов превращения N-оксида фосфонометилимино-диуксусной кислоты может лежать в основе отрицательных эффектов, приписываемых чистому глифосату.
Ещё одна токсикологическая проблема связана с хорошей комплексообразующей способностью глифосата. Оказалось, что в регионах с повышенным содержанием в почве тяжёлых металлов (мышьяк, ртуть, кадмий и др.), где употребляют воду из источников, в которые она может попадать с обработанных глифосатом сельскохозяйственных угодий, отмечено большое число заболеваний почек со смертельным исходом. Так, например, в странах Центральной Америки, в Индии и в Шри-Ланке, отмечены десятки тысяч смертей сельских жителей, в моче которых обнаруживалось высокое содержание глифосата и тяжёлых металлов. В более развитых странах, где употребляют воду из чистых источников, случаев таких заболеваний не отмечено. Все эти отрицательные факторы, сопровождающие практическое использование гербицидных составов с глифосатом, послужили основанием для отказа от них во многих странах. При этом можно отметить, что суды в США до сих пор выносят решения о выплате многомиллионых штрафов компанией Монсанто по искам людей с онкологическими заболеваниями.
При изучении антибиотиков, продуцируемых актиномицетами Streptomyces viridochromogenes, был выделен трипептидный антибиотик, получивший обозначение SF-1293:
В состав этого соединения входят две молекулы аланина и фосфорорганическая аминокислота, которую выделившие её впервые швейцарские исследователи назвали фосфинотрицином. Антибиотик SF‑1293, микробиологическое производство которого налажено в Японии, используется в качестве гербицида под названием Биалафос, а в ФРГ выпускается аммонийная соль фосфинотрицина под торговой маркой БАСТА, при этом действующее вещество этого гербицида там решили называть глюфосинатом аммония.
Совершенно очевидно, что биологическая активность этой аминокислоты основана на её структурном подобии глютаминовой кислоте. Превращение глютаминовой кислоты в глютамин идёт с участием АТФ при катализе глютаминсинтетазой. Именно этот процесс блокируется фосфинатным аналогом глютаминовой кислоты. Глюфосинат встраивается в активный центр глютаминсинтетазы, но его амидирование по метилфосфинатной группе, соответствующей γ‑карбоксилатной группе глютаминовой кислоты, с участием АТФ невозможно, поскольку энергия образования РО-связи значительно превышает энергию образования PN-связи. Непрореагировавший субстрат не может покинуть реакционный центр, что приводит к необратимому ингибированию фермента. Следствием этого становится прекращение биосинтеза глютамина.
Глютамин – это белковая аминокислота, но только недостатком глютамина для построения белков нельзя объяснить фитотоксический эффект глюфосината, поскольку скорость поражения растений этим гербицидом слишком велика для того, чтобы можно было ограничить его действие одним этим эффектом. Вероятнее всего здесь участвуют ещё и процессы светового дыхания, в результате которого образуется гликолевая кислота. Её ассимиляция идёт через токсичную глиоксиловую кислоту, превращающуюся в глицин с участием глютамина. Поэтому недостаток в клетках растений свободного глютамина вызывает накопление глиоксиловой кислоты с эффектом, аналогичным фотодинамическому поражению растений.
Патентные данные по синтезу этого гербицида достаточно обширны. Основной путь, защищаемый патентами, представлен реакцией свободнорадикального присоединения моноэфира метилфосфонистой кислоты к различным производным акролеина с последующим превращением альдегидной группы в концевой фрагмент аминокислот по реакции Штрекера или Бухерера-Бергса, например, по схеме с использованием диэтилацеталя акролеина и с переводом альдегидной группы в аминокислотную по реакции Штрекера:
Известны, конечно, и более сложные, традиционные для синтеза аминокислот способы получения глюфосината аммония, которые, однако, непригодны для промышленной реализации. При этом надо отметить, что и представленная выше цепочка превращений вряд ли может быть реализована для получения глюфосината аммония в промышленном масштабе.
Получение β-метилалкоксифосфорилзамещённого пропионового альдегида можно проводить по реакции диэфира метилфосфонистой кислоты с акролеином, протекающей по схеме:
Полученный фосфорсодержащий виниловый эфир превращается в соответствующий альдегид в результате гидролиза в кислой среде:
Превращение альдегида в аминокислоту может протекать по реакции Бухерера–Бергса через соответствующий замещенный гидантоин, который гидролизуют с образованием фосфинотрицина в щелочной среде под давлением:
Следует отметить, что реакция Бухерера–Бергса с участием цианида и карбоната аммония протекает с более высоким выходом по конечному продукту, чем реакция Штрекера, в которой промежуточным продуктом является нитрил аминокислоты.
Несмотря на то, что блокируемая глюфосинатом глютаминсинтетаза участвует в метаболизме всех видов живого, для теплокровных это вещество не очень токсично (ЛД50 от 400 до 600 мг/кг). Однако более тщательные исследования токсикологических характеристик глюфосината аммония показали, что он репротоксичен. Как было показано в опытах на животных, его поступление в организм в сублетальных количествах вызывает, в частности у крыс, преждевременные роды, внутриутробную смерть и выкидыши. Японские исследователи обнаружили также, что глюфосинат вызывает задержки в развитии и функционировании центральной нервной системы человека. Это может быть связано с тем, что блокируемое глюфосинатом превращение глютаминовой кислоты в глютамин представляет собой основной путь детоксикации метаболического аммиака в клетках головного мозга, и даже незначительное повышение его уровня в нейронах может отрицательно сказываться на их функционировании. Также доказана токсичность глюфосината для бабочек и некоторых полезных насекомых, моллюсков, личинок устриц, пресноводных рыб. Установлено, что эта фосфорорганическая аминокислота подавляет активность полезных почвенных бактерий и грибов. При этом глюфосинат относится к персистентным агрохимическим препаратам. Он обнаруживается в растениях и через несколько недель после обработки. В соответствии с этим в 2009 г. было принято решение о запрещении использования гербицида БАСТА в странах Евросоюза. Тем не менее, в отдельных странах ЕС продлевают разрешение на содержащие глюфосинат гербициды. Так, например, компания БАСФ продолжает продажу гербицида БАСТА в качестве десиканта.