5. Ферментативный гидролиз крахмала

Основным процессом при переработке крахмалсодержащего сырья в бродильных производствах является гидролиз крахмала амилолитическими ферментами солода и ферментных препаратов. Углеводная часть крахмала состоит из двух полисахаридов: амилозы и амилопектина.

Амилоза и амилопектин построены из остатков глюкозы С₆Н₁₀О₅. Амилоза имеет молекулярную массу 3·10⁵ – 1·10⁶, молекулярная масса амилопектина достигает сотен миллионов. Схема строения молекулы амилозы представлена в виде длинной цепочки глюкозных остатков, связанных глюкозидными α-1,4-связями. В молекуле амилозы соединены несколько таких параллельно расположенных цепочек. В каждой из них глюкозные остатки расположены по спирали. Схема строения молекулы амилопектина представлена в виде разветвленной цепи, состоящей из большого числа глюкозных остатков (около 2500). Главная цепочка, к которой присоединяются боковые ветви, состоит из 25 – 30 глюкозных остатков. Каждая же отдельная боковая ветвь состоит из 15 – 18 остатков, а внутренние отрезки цепей (между ветвления) – из 8 – 9 таких остатков. Боковые цепочки, в свою очередь, связаны с соседними цепочками. В амилопектине остатки глюкозы в пределах одной цепочки связаны между собой, так же как в амилозе, α-1,4-связью. Но связь между отдельными цепочками в амилопектине осуществляется α-1,6-глюкозидными связями.

Ферментативный гидролиз крахмала проводится амилолитическими ферментами. Амилолитический комплекс солода (проросшего зерна) состоит из α- и β-амилазы и декстриназы (олиго-α-1,6-глюкозидазы). В ферментных препаратах присутствуют α-амилаза, олиго-α-1,6-глюкозидаза и глюкоамилаза. Каждый фермент имеет свои специфические особенности, которые обусловливают определенные качественные характеристики получаемых продуктов.

α-Амилаза – эндофермент, гидролизующий α-1,4-связи внутри молекулы амилозы и амилопектина. Механизм действия фермента многоцепочный, неупорядоченный; в результате образуются продукты неполного гидролиза крахмала – α-декстрины, поэтому α-амилазу называют декстринирующим ферментом. При длительном действии α-амилазы на амилозу фермент почти полностью превращают ее в мальтозу и небольшое количество глюкозы.

Действие α-милазы на амилопектин приводит к образованию мальтозы и низкомолекулярных декстринов с 5 – 8 глюкозными остатками. Такое поведение α-амилазы обусловлено тем, что фермент не действует на α-1,6-глюкозидные связи в местах разветвления макромолекул амилопектина.

β-Амилаза – экзофермент, гидролизующий α-1,4-связи с нередуцирующих концов молекул амилозы и амилопектина с образованием мальтозы. Она является сахарофицирующим ферментом, который не расщепляет α-1,6-связи.

При совместном действии α- и β-амилаз на крахмал 95 % превращается в мальтозу и 5 % - в низкомолекулярные предельные декстрины, содержащие α-1,6-глюкозидные связи.

В просяном и овсяном солодах содержится фермент декстриназа, разрывающий α-1,6-глюкозидную связь в амилопектине и предельных декстринах.

Глюкоамилазе – экзофермент, расщепляющий как α-1,4-, так и α-1,6-глюкозидные связи. Действуя с нередуцируемых концов молекул амилозы и амилопектина, глюкоамилаза отщепляет молекулу глюкозы в β-форме.

Основными факторами, влияющими на скорость ферментативных реакций, являются температура, рН, концентрация веществ в субстрате и ферментов. С повышением температуры ферментативный гидролиз крахмала ускоряется, однако по достижении определенной температуры происходит инактивация ферментов.

β-Амилаза ячменного солода имеет низкую термостойкость при нагревании до 70 С, она разрушается; тепловая инактивация данного фермента при 70 С почти полностью завершается за несколько минут.

α-Амилаза ячменного солода обладает более высокой термостойкостью и разрушается при температуре около 80 С.

Оптимальная температура для β-амилазы в заторе 63 С, а для α амилазы 70 С. В оптимальных условиях одна молекула β-амилазы может гидролизовать 237000 связей в минуту.

Оптимальная температура действия глюкоамилазы микроскопических грибов и бактерий 55 – 60 С. α-Амилаза ферментных препаратов бактериального происхождения обладает высокой термостойкостью. Ее оптимальная температура действия 85 – 95 С.

Каждый фермент имеет оптимум рН, при котором он наиболее активен; при более высоких или более низких значениях рН активность фермента снижается. Максимальная активность α-амилазы проявляется при рН 5,7, а β-амилазы – при рН около 4,8. при рН 2,3 и 9,7 амилазы полностью инактивируются.

Оптимальная величина рН для α-амилазы микроскопических грибов составляет 4,5 – 5,0, для глюкоамилазы – 4,5 – 4,6, для бактериальной α-амилазы – 5,0 – 6,0.

Скорость ферментативной реакции с увеличением концентрации фермента увеличивается, но до известного предела. До образования 75 – 80 % теоретического количества мальтозы (79,1 – 84,4 г из100 г крахмала) реакция осахаривания протекает быстро, а затем резко замедляется: идет в 1000 раз медленнее, чем в начале расщепления.

С увеличением концентрации экстрактивных веществ в субстрате ферментативный гидролиз крахмала замедляется. Это объясняется тем, что с увеличением концентрации веществ увеличивается вязкость затора, вследствие чего затрудняется процесс диффузии между субстратом и ферментом.

Гидролиз крахмала контролируют обычно по окраске, которую дают промежуточные продукты гидролиза с йодом. Окрашивание происходит в результате расположения молекул йода внутри спиральных витков глюкозных остатков. Цвет образовавшихся соединений обусловлен длиной цепочки глюкозных остатков.

Крахмал с йодом дает синее окрашивание. Близкие к крахмалу самые крупные декстрины – амилодекстрины (молекулярная масса 10000 – 12000) окрашиваются йодом в фиолетово-синий цвет; более мелкие декстрины – эритродекстрины (молекулярная масса 4000 – 7000) – в красно-бурый; самые мелкие – ахродекстрины и мальтодекстрины (молекулярная масса 2900 – 3700) совершенно не окрашиваются.

Сырой неоклейстеризованный крахмал расщепляется под действием амилаз, но очень медленно. Атакуемость амилолитическими ферментами при их действии на клейстеризованный крахмал усиливается. Для ускорения процесса клейстеризации и растворения крахмала зернопродуктов целесообразно подвергать их предварительной тепловой обработке путем запаривания под давлением. При нагревании с водой крахмал переходит из твердого состояния в студнеобразное – он клейстеризуется. При этом происходит набухание крахмальных зерен (гранул) с последующим их разрывом и диспергированием.

С повышением температуры клейстер начинает разжижаться, а затем становится жидким.

Итак, в ходе гидролиза крахмала нужно различать три стадии: клейстеризацию, разжижение и осахаривание.

Требования к ферментативному гидролизу крахмала в бродильных производствах различны. Так, в спиртовом производстве стремятся получить максимально возможное количество сбраживаемых сахаров, так как декстрины непосредственно дрожжами не сбраживаются. В условиях спиртового производства осахаривание декстринов происходит на стадии брожения, когда уже большая часть мальтозы сброжена. Этот процесс имеет большое значение с точки зрения получения наибольшего выхода спирта из крахмала. Поэтому очень важно, чтобы осахаривающие ферменты сохранили свою активность до конца брожения.

В пивоваренном производстве гидролиз крахмала необходимо проводить так, чтобы в сусле кроме мальтозы присутствовало определенное количество ахро- и мальтодекстринов, обусловливающих полноту вкуса и вязкость пива. Для сортов светлого пива гидролиз крахмала ведут до тех пор, пока не образуется 80 – 85 % сбраживаемых сахаров и 15 – 20 % декстринов, не окрашиваемых йодом.

Ферментативный гидролиз белков

В спиртовой и пивоваренной промышленности важное значение имеют продукты гидролиза белков. Аминокислоты и низкомолекулярные пептиды необходимы для жизнедеятельности дрожжей. В пивоварении белки и продукты их гидролиза влияют на вкус, цвет, пенообразование, пенную и коллоидную стойкость пива.

Белковые вещества относятся к высокомолекулярным соединениям с молекулярной массой несколько миллионов и большим размером молекул. В состав белков входят углерод, азот, водород, кислород и сера, а в некоторых – фосфор.

Все белки разделяют на две группы: протеины, или простые белки, состоящие только из остатков аминокислот, и протеиды, или сложные белки, которые являются соединением простого белка с каким-либо веществом небелковой природы, называемым простетической группой. Протеины в зависимости от растворимости делят на альбумины (растворимые в воде), глобулины (растворимые в водных растворах солей), проламины (растворимые в 60 – 80 % этаноле) и глютелины (растворимые в растворах щелочей и частично в разбавленных кислотах).

Протеиды в зависимости от химической природы простетической группы разделяют на липопротеиды, содержащие жироподобные вещества – липопротеиды; гликопротеиды, в состав которых входит какой-либо высокомолекулярный углевод; хромопротеиды, содержащие пигменты, нуклеопротеиды, содержащие нуклеиновую кислоту.

Гидролитическое расщепление белков осуществляется под действием протеолитических ферментов. По классификации Бергмана протеолитические ферменты делятся на эндопетидазы, которые могут действовать на центральные участки пептидной цепи и расщеплять молекулу белка на более мелкие фрагменты, и экзопептидазы, которые не гидролизуют пептидные связи, находящиеся в середине цепи, а действуют либо с карбоксильного, либо с аминного конца цепи, отщепляя последовательно одну за другой концевые аминокислоты.

Эндо- и экзопептидазы, расщепляя белок, действуют согласованно: первые образуют большое число свободных концов, а вторые воздействуют на образовавшиеся фрагменты.

Разрыв пептидной связи происходит по уравнению

R – CJ + NH – R₁ + HOO RCOOH + H₂NR₁

где R и R₁ – остатки аминокислот и пептидов.

Возможно, что под действием протеолитических ферментов происходит не только гидролитический разрыв пептидных связей, но и распад белковых макромолекул на субъединицы, как распад крахмала на декстрины. Под субъединицей понимают одну полипептидную связь. Схема ферментативного расщепления белков может быть представлена так:

Белки → Альбумозы → Пептоны → Полипептиды →

→Пептиды и Аминокислоты.

Пептоны и полипептиды обуславливают пенообразование и пеностойкость пива, а пептиды и аминокислоты используются дрожжами как источники азотистого питания. Оптимальные условия гидролиза белковых веществ: рН 4,5 – 5,0; температура 45 – 50 С. Данная температура наиболее благоприятна для накопления низкомолекулярных фракций белков и аминокислот и называется температурой пептонизации. Однако и при 60 С также расщепляется много белковых веществ с накоплением белковых фракций, осаждаемых сульфатом аммония. Ферментативный гидролиз белков при

60 С приводит к накоплению всех компонентов фракций стойкорастворимых белков, не коагулируемых при кипячении (альбумоз, пептонов, полипептидов и аминокислот), т. е. накапливаются продукты распада, обеспечивающие пенообразование. При 50 С ферментативный гидролиз белков приводит к накоплению наибольшего количества аминокислот.

До сих пор еще нет легко выполняемых способов контроля ферментативного гидролиза белков. Но все же обстоятельное представление о расщеплении белков дает метод Лундина. Согласно этому методу растворимые азотсодержащие вещества сусла по осаждаемости танином и фосфорно-молибденовой кислотой подразделяют на три группы:

фракция А высокомолекулярные азотистые вещества (лейкозин, эдестин, альбумозы);

фракция В – среднемолекулярные азотистые вещества (пептоны и высшие полипептиды);

фракция С – неосаждаемые азотистые вещества (низшие полипептиды и аминокислоты).

Фракция В предназначена для пенообразования. В среднем фракция А составляет 25 %, фракция В – 15 %, фракция С – 60 %. Для получения пивного сусла и готового пива нормального состава большое значение имеет правильно проведенный гидролиз как крахмала, так и белков. При недостаточном распаде белков происходит резкое ухудшение органолептических свойств пива и понижение его стойкости.