20. Цитратный цикл: последовательность реакций, ферменты связь с цпэ. Энергетическая эффективность и аллостерическая регуляция процесса. Реакции, пополняющие цитратный цикл.

Цикл лимонной кислоты- заключительный этап катаболизма, в котором углерод ацетильного остатка ацетил- КоА окисляется до 2 молекул СО₂. Атомы водорода, освобождающиеся в окислительно-восстановительных реакциях, доставляются в ЦПЭ при участии NAD- и FAD-зависимых дегидрогеназ, в результате чего происходят синтез воды и окислительное фосфорилирование АДФ. Связь между атомами углерода в ацетил-КоА устойчива к окислению. 1 стадия. Метильная группа в составе ацетильной группы ацетил-СоА присоединяется к карбонильной группе оксалоацетата. Сначала образуется промежуточное соединение цитроил-СоА, быстро подвергается гидролизу и расщепляется на свободный СоА и цитрат, которые удаляются из активного центра фермента. 

2 стадия. Фермент аконитаза катализирует обратимую изомеризацию цитрата в изоцитрат через образование промежуточного соединения — трикарбоновой кислоты цис-аконитата, которая при этом в норме не покидает активный центр.

3.Фермент изоцитратдегидрогеназа катализирует окислительное декарбоксилирование изоцитрата с образованием α-кетоглутарата (оксоглутарата). Ион Mn²⁺ (или Mg²⁺) в активном центре фермента взаимодействует с карбонильной группой промежуточного соединения оксалосукцината, который образуется быстро, однако не покидает активного центра до тех пор, пока не декарбоксилируется и не превратится в α-кетоглутарат.

4 стадия. Происходит окислительное декарбоксилирование, при котором α-кетоглутарат превращается в сукцинил-СоА и СО₂ под действием α-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса; в качестве акцептора электронов выступает NAD⁺, а СоА функционирует как переносчик сукцинильной группы.

5 стадия. Энергия, выделяемая при расщеплении тиоэфирной связи сукцинила-СоА , используется на образование фосфоангидридной связи в GTP (гуанозинтрифосфат) или ATP (аденозинтрифосфат), при этом сукцинил-СоА превращается в сукцинат. Эта обратимая реакция катализируется ферментом сукцинил-СоА-синтазой (сукцинилтиокиназой), в этой реакции участвует нуклеозидтрифосфат

6 стадия. Сукцинат, образовавшийся из сукцинил-СоА, окисляется в фумарат под действием флавопротеинасукцинатдегидрогеназы:

7 стадия. Обратимая гидратация фумарата с образованием L-малата катализируется ферментом фумаразой (точнее,фумаратгидратазой). Переходным продуктом этой реакции является карбанион

8 стадия. В последней реакции цикла трикарбоновых кислот NAD-зависимый фермент L-малатдегидрогеназа катализирует окисление L-малата до оксалоацетата

Энергетическое значение цитратного цикла. В одном обороте цикла лимонной кислоты в 2 реакциях декарбоксилирования (3 и 4) происходит образование 2 молекул СО₂. В 4 реакциях цитратного цикла происходит дегидрирование с образованием восстановленных коферментов: 3 молекул NADH+H⁺ и 1 молекулы FADH₂. На один оборот цикла затрачивается 2 молекулы воды: одна – на 1 стадии, вторая - на 7 стадии. Восстановленные коферменты отдают электроны в ЦПЭ на кислород - конечный акцептор электронов. Восстановленный кислород взаимодействует с протонами с образованием воды. На каждую молекулу NADH при образовании молекулы воды в процессе тканевого дыхания синтезируются 3 молекулы АТФ, а на каждую молекулу FADH₂ - 2 молекулы АТФ. Оборот цикла лимонной кислоты сопровождается синтезом 11 молекул АТФ путём окислительного фосфорилирования и 1 молекула АТФ- путём субстратного фосфорилирования. В итоге на каждый ацетильный остаток - 12 молекул АТФ.

	Ингибиторы	Активаторы
Цитратсинтаза	АТФ, цитрат, НАДН, ацил-S-КоА
Изоцитрат-дегидрогеназа	АТФ, НАДН	АМФ, АДФ
α-Кетоглутарат-дегидрогеназа	Сукцинил-S-КоА, НАДН	цАМФ

Главным и основным регулятором ЦТК является оксалоацетат, а точнее его доступность. Наличие оксалоацетата вовлекает в ЦТК ацетил-SКоА и запускает процесс. Некоторые ферменты ЦТК являются чувствительными к аллостерической регуляции метаболитами. Реакции, пополняющие цитратный цикл (анаплеротические реакции). При деградации большинства аминокислот образуются пируват или промежуточные продукты цикла. Особенно важной анаплеротической реакцией в организме человека является превращение пирувата в оксалоацетат. Эта реакция поддерживает необходимую высокую концентрацию оксалоацетата в митохондриях и обеспечивает субстратом первую реакцию цикла. Нарушение образования оксалоацетата (при голодании, диабете) ведет к взаимной конденсации молекул ацетил-КоА друг с другом и вызывает образование кетоновых тел, главным образом – ацетоацетата (СН3-СО-СН2-СООН). У здоровых людей эта АТФ-зависимая реакция позволяет включать в глюконеогенез лактат и аминокислоты, распадающиеся до пирувата.

21. Процессы дегидрирования - первый этап тканевого дыхания, характеристика НАД- и ФАД-зависимых дегидрогеназ. Структурная организация дыхательной цепи. Особенности структуры компонентов ЦПЭ, редокс-потенциалы, последовательность реакций. Хемиосмотический механизм сопряжения окисления с фосфорилированием. Строение АТФ-синтазы и синтез АТФ. Дыхательный контроль. Стехиометрический коэффициент окислительного фосфорилирования Р/О и его изменения в норме и патологии. Ингибиторы и разобщители тканевого дыхания. Терморегуляторная функция тканевого дыхания. Гипоэнергетические состояния.

Тканевое дыхание.Наиболее важными экзергоническими реакциями метаболизма являются реакции окисления органических веществ, в которых используется кислород и образуется вода и СО₂. Совокупность этих реакций называется тканевым дыханием. Первый этап тканевого дыхания - дегидрирование различных субстратов, образующихся в реакциях катаболизма. Ферменты, отщепляющие водород от субстратов (дегидрогеназы), находятся в основном в матриксе митохондрий. В зависимости от строения коферментов, дегидрогеназы делятся на две группы: NAD-зависимые и FAD -зависимые дегидрогеназы. В NAD -зависимых дегидрогеназах NAD непрочно связан с ферментом; в восстановленной форме(NADH) он отделяется от апофермента и служит донором водорода для другого фермента.

Дегидрирование малата

В  FAD-зависимых дегидрогеназах FAD ковалентно связан с апоферментом, поэтому в реакциях, катализируемых FAD-зависимыми дегидрогеназами, участвует второй субстрат (акцептор водорода). Для всех флавиновых ферментов этим субстратом служит убихинон (коэнзимQ).

Дегидрирование сукцината

  Перенос электронов на кислород происходит при участии системы переносчиков, локализованных во внутренней мембране митохондрий и образующих цепь переноса электронов (ЦПЭ).

Рис. 5.6. Пути поступления электронов и протонов в ЦПЭ от первичных доноров.

Высокомолекулярные комплексы, расположенные во внутренней мембране митохондрий: NADH-дегидрогеназа (комплекс I), СН₂-дегидрогеназа (комплекс III), цитохромоксидаза (комплекс IV). NAD-зависимые дегидрогеназы локализованы в матриксе митохондрий. Большинство FAD-зависимых дегидрогеназ также находится в матриксе; сукцинатдегидрогеназа (комплекс II), в отличие от других FAD- зависимых дегидрогеназ, является компонентом внутренней мембраны митохондрий, но на рисунке не представлена

В состав ЦПЭ входят: NADH-дегидрогеназа (комплекс I), сукцинатдегидрогеназа (комплекс II), QН₂-дегидрогеназа (комплекс III), цитохромоксидаза (комплекс IV), а также низкомолекулярные переносчики (кофермент Q и цитохром с).

2. Все компоненты ЦПЭ расположены в митохондриальной мембране в порядке возрастания редокс-потенциалов;самый высокий редокс-потенциал у кислорода. Это обеспечивает последовательное перемещение электронов от дегидрируемых субстратов на кислород, сопровождающееся освобождением части свободной энергии электронов. Хемиосмотическая теория:Механизм сопряжения окисления и фосфорилирования.Каким же образом осуществляется сопряжение этих двух процессов? Наиболее обоснованный ответ на этот вопрос даёт хемиосмотическая теория Митчелла, предложенная им в 1961 г. Основные положения были подтверждены и разработаны детально совместными усилиями многих исследователей в последующие годы: Протонный градиент и электрохимический потенциал. Перенос электронов по дыхательной цепи от NADH к кислороду сопровождается выкачиванием протонов из матрикса митохондрий через внутреннюю мембрану в межмембранное пространство. На эту работу затрачивается часть энергии электронов, переносимых по ЦПЭ. Протоны, перенесённые из матрикса в межмембранное пространство, не могут вернуться обратно в матрикс, так как внутренняя мембрана непроницаема для протонов. Таким образом, создаётся протонный градиент, при котором концентрация протонов в межмембранном пространстве больше, а рН меньше, чем в матриксе. Кроме того, каждый протон несёт положительный заряд, и вследствие этого появляется разность потенциалов по обе стороны мембраны: отрицательный заряд на внутренней стороне и положительный - на внешней. В совокупности электрический и концентрационный градиенты составляют электрохимический потенциал ΔμН⁺ - источник энергии для синтеза АТФ.

 Строение АТФ-синтазы и синтез АТФ. АТФ-синтаза (Н⁺-АТФ-аза) - интегральный белок внутренней мембраны митохондрий. Он расположен в непосредственной близости к дыхательной цепи. АТФ-синтаза состоит из 2 белковых комплексов, обозначаемых как F₀ и F₁. Гидрофобный комплекс F₀ погружён в мембрану. Он служит основанием, которое фиксирует АТФ-синтазу в мембране. Комплекс F0 состоит из нескольких субъединиц, образующих канал, по которому протоны переносятся в матрикс.

Каталитический цикл синтеза АТФ включает 3 фазы, каждая из которых проходит поочерёдно в 3 активных центрах: 1 - связывание АДФ и Н₃РО₄; 2 - образование фосфоангидридной связи АТФ; 3 - освобождение конечного продукта. При каждом переносе протонов через канал F₀ в матрикс все 3 активных центра катализируют очередную фазу цикла. Энергия электрохимического потенциала расходуется на поворот стержня, в результате которого циклически изменяется конформация α- и β-субъединиц и происходит синтез АТФ.

Дыхательный контроль.  Зависимость интенсивности дыхания митохондрий от концентрации АДФ называют дыхательным контролем. Механизм дыхательного контроля характеризуется высокой точностью и имеет важное значение, так как в результате его действия скорость синтеза АТФ соответствует потребностям клетки в энергии. Запасов АТФ в клетке не существует. Относительные концентрации АТФ/АДФ в тканях изменяются в узких пределах, в то время как потребление энергии клеткой, т.е. частота оборотов цикла АТФ и АДФ, может меняться в десятки раз.Общее содержание АТФ в организме 30-50 г, но каждая молекула АТФ в клетке "живёт" меньше минуты. В сутки у человека синтезируется 40-60 кг АТФ и столько же распадается. Увеличение концентрации АДФ немедленно приводит к ускорению дыхания и фосфорилирования. Коэффициент окислительного фосфорилирования. Окисление молекулы NADH в ЦПЭ сопровождается образованием 3 молекул АТФ; электроны от FAD-зависимых дегидрогеназ поступают в ЦПЭ на KoQ, минуя первый пункт сопряжения. Поэтому образуются только 2 молекулы АТФ. Отношение количества фосфорной кислоты (Р), использованной на фосфорилирование АДФ, к атому кислорода (О), поглощённого в процессе дыхания, называют коэффициентом окислительного фосфорилирования и обозначают Р/О. Следовательно, для NADH Р/О = 3, для сукцината Р/О - 2. Эти величины отражают теоретический максимум синтеза АТФ, фактически эта величина меньше. Разобщение дыхания и фосфорилирования. Некоторые химические вещества (протонофоры) могут переносить протоны или другие ионы (ионофоры) из межмембранного пространства через мембрану в матрикс, минуя протонные каналы АТФ-синтазы. В результате этого исчезает электрохимический потенциал и прекращается синтез АТФ. Это явление называют разобщением дыхания и фосфорилирования. В результате разобщения количество АТФ снижается, а АДФ увеличивается. В этом случае скорость окисления NADH и FADH₂ возрастает, возрастает и количество поглощённого кислорода, но энергия выделяется в виде теплоты, и коэффициент Р/О резко снижается. Как правило, разобщители - липофильные вещества, легко проходящие через липидный слой мембраны. Одно из таких веществ - 2,4-динитрофенол, легко переходящий из ионизированной формы в неионизированную, присоединяя протон в межмембранном пространстве и перенося его в матрикс. Примерами разобщителей могут быть также некоторые лекарства, например дикумарол – антикоагулянт, или метаболиты, которые образуются в организме, билирубин, тироксин - гормон щитовидной железы. Все эти вещества проявляют разобщающее действие только при их высокой концентрации. Терморегуляторная функция тканевого дыхания.На синтез молекул АТФ расходуется примерно 40-45% всей энергии электронов, переносимых по ЦПЭ, приблизительно 25% тратится на работу по переносу веществ через мембрану. Остальная часть энергии рассеивается в виде теплоты и используется теплокровными животными на поддержание температуры тела. В последние годы появились факты, свидетельствующие о существовании в митохондриях разных органов и тканей млекопитающих разобщающих белков, похожих по своей структуре на РБ-1(термогенин) бурой жировой ткани. На внешней стороне мембраны анион жирной кислоты присоединяет протон и в таком виде пересекает мембрану; на внутренней стороне мембраны диссоциирует, отдавая протон в матрикс и тем самым снижает протонный градиент. Образующийся анион возвращается на наружную сторону мембраны с помощью АТФ/ АДФ-антипортера.При охлаждении стимулируется освобождение норадреналина из окончаний симпатических нервов. В результате происходят активация липазы в жировой ткани и мобилизация жира из жировых депо (см. раздел 8). Образующиеся свободные жирные кислоты служат не только "топливом", но и важнейшим регулятором разобщения дыхания и фосфорилирования.

22. Роль процессов свободно-радикального окисления в нормальной жизнедеятельности организма человека. Первичные и вторичные радикалы. Активные формы кислорода (супероксидный ион-радикал•О2-, Н2О2 , гидроксильный радикал OH•,синглетный кислород 1О2), гипогалоидный ион OCl-, оксид азота (II): пути образования, биологическая роль. Дыхательная цепь митохондрий - основной источник АФК.

Активация процессов свободнорадикального окисления представляет собой важный фактор поражения мозгового вещества в условиях острой и хронической ишемии.

Изучение процессов свободнорадикального окисления (СРО) в организме человека имеет важное значение для понимания их роли в нормальной жизнедеятельности и в развитии патологических состояний. В настоящее время не вызывает сомнений, что СРО участвует в развитии ряда заболеваний человека в качестве ключевого звена патогенеза, а в остальных случаях может существенно отягощать течение любой патологии. Не случайно усиление СРО биологически значимых молекул рассматривается как неспецифический патологический процесс, сопровождающий любое заболевание.

Важно заметить, что вредным является не простое повышение уровня СРО, а нарушение некоего определенного (физиологического) баланса между интенсивностью СРО и функциональной активностью антиоксидантной системы (АОС) организма. Выяснение реальной взаимосвязи этого дисбаланса с развитием патологических изменений является достаточно трудным в силу сложности процессов СРО и многокомпонентности АОС. В ходе своих исследований мы пытаемся нащупать методологические подходы, которые позволили бы создать доступный комплекс анализов, достаточный для оценки указанной взаимосвязи.

Классификация свободных радикалов. «Полезные» радикалы и радикалы–«убийцы».

Свободные радикалы отличаются от обычных молекул тем, что у них на внешней электронной оболочке имеется неспаренный (одиночный) электрон. Неспаренный электрон в радикалах принято обозначать точкой. Например, радикал гидроксила обозначают как HO•, радикал перекиси водорода как HOO•, радикал супероксида как •OO- или O2•-. Ниже даны формулы трех радикалов этилового спирта: CH3CH2O•; CH3•CHOH; CH3CH2O• Свободным радикалом называется частица - атом или молекула, имеющая на внешней оболочке один или несколько неспаренных электронов. Это делает радикалы химически активными, поскольку радикал стремится либо вернуть себе недостающий электрон, отняв его от окружающих молекул, либо избавиться от "лишнего" электрона, отдавая его другим молекулам. В особом положении оказалась молекула кислорода (диоксигена), которая содержит на внешней оболочке целых два неспаренных электрона. Таким образом, диоксиген - это бирадикал и, подобно другим радикалам, обладает высокой реакционной способностью. Первичные радикалы и реактивные молекулы. Все радикалы, образующиеся в нашем организме, можно разделить на природные и чужеродные. В свою очередь природные радикалы можно разделить на первичные, вторичные и третичные. Первичными можно назвать радикалы, образование которых осуществляется при участии определенных ферментных систем. Прежде всего к ним относятся радикалы (семихиноны), образующиеся в реакциях таких переносчиков электронов, как коэнзим Q (обозначим радикал как Q•) и флавопротеины. Два других радикала - супероксид (•OO-) и монооксид азота (•NO) также выполняют полезные для организма функции, которые будут подробнее рассмотрены в соответствующих разделах. Из первичного радикала - супероксида, а также в результате других реакций, в организме образуются весьма активные молекулярные соединения: перекись водорода, гипохлорит и гидроперекиси липидов. Реактивные молекулы: перекись водорода, гидроперекиси липидов, пероксинитрит, - образуются в реакциях, одним из участников которых в большинстве случаев является радикал, а иногда - диоксиген, который, впрочем, тоже имеет неспаренные электроны на внешней электронной оболочке. В свою очередь, эти молекулы, а наряду с ними - гипохлорит, охотно образуют радикалы в присутствии ионов металлов переменной валентности, в первую очередь - ионов двухвалентного железа. Такие радикалы мы будем называть вторичными; сюда относятся радикал гидроксила и радикалы липидов. Вторичные радикалы, в отличие от первичных, образуются в неферментативных реакциях и, насколько известно в настоящее время, не выполняют физиологически-полезных функций. Напротив, они обладают разрушительным действием на клеточные структуры и с полным основанием могут быть названы вредными радикалами. Именно образование вторичных радикалов (а не радикалов вообще) приводит к развитию патологических состояний и лежит в основе канцерогенеза, атеросклероза, хронических воспалений и нервных дегенеративных болезней. Для защиты от повреждающего действия вторичных радикалов в организме используется большая группа веществ, называемых антиоксидантами, к числу которых принадлежат ловушки, или перехватчики свободных радикалов. Примером последних служат альфа-токоферол, тироксин, восстановленный убихинон (QH2) и женские стероидные гормоны. Реагируя с липидными радикалами, эти вещества сами превращаются в радикалы антиоксидантов, которые можно рассматривать как третичные радикалы. Наряду с этими радикалами, постоянно образующимися в том или ином количестве в клетках и тканях нашего организма, разрушительное действие могут оказывать радикалы, появляющиеся при таких воздействиях, как ионизирующее излучение, ультрафиолетовое облучение или даже освещение интенсивным видимым светом, например, светом лазера. Такие радикалы можно назвать чужеродными. К ним принадлежат также радикалы, образующиеся из попавших в организм посторонних соединений, ксенобиотиков, многие из которых оказывают токсическое действие именно благодаря свободным радикалам, образующимся при метаболизме этих соединений.

23. Перекисное окисление липидов (ПОЛ), механизм. Понятие о карбонилировании белков. Окислительный стресс, понятие. Антиоксидантные ферменты: каталаза, супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, особенности строения, катализируемые реакции. Роль витаминов А, Е, С, β-каротина, убихинона, глутатиона, церулоплазмина, системы ферритин-трансферин в антиоксидантной защите.

Реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) являются свободнорадикальными и постоянно происходят в организме. Свободнора-дикальное окисление нарушает структуру многих молекул. ПОЛ - цепные реакции, обеспечивающие расширенное воспроизводство свободных радикалов, частиц, имеющих неспаренный электрон, которые инициируют дальнейшее распространение перекисного окисления.

Стадии перекисного окисления липидов