4. Получение клеточных препаратов: выделение из тканей и манипуляции in vitro. В соответствии с определением, данным фз n 180-фз «о биомедицинских клеточных продуктах»:

биомедицинский клеточный продукт - комплекс, состоящий из клеточной линии (клеточных линий) и вспомогательных веществ либо из клеточной линии (клеточных линий) и вспомогательных веществ в сочетании с прошедшими государственную регистрацию лекарственными препаратами для медицинского применения (далее - лекарственные препараты) и (или) медицинскими изделиями;

Как сказала Сысоева- главный критерий клеточных препаратов: чтобы с клетками проводились предварительные манипуляции (пассирование, ведение клеточной линии)

И опять таки, исходя из сказанного ею на консультации, этот билет повторяет билет о первичных клеточных культурах (то есть см предыдущий билет №3, там же и общая схема получения клеточных линий).

Приведу общую схему получения клеточных линий:

После того, как получили первичную культуру, начинаем с ней манипуляции! пассирование- операция, осуществляемая с клетками и клеточными линиями при посеве их на субстрат для дальнейшей культивации. Единичная операция пассирования клеток называется пассаж. В зависимости от типа клеточной линии, клетки сохраняют свои первичные свойства до 5—15 пассажа.

После того, как первичная культура достигнет состояния монослоя, она может быть перенесена во второй культуральный сосуд после диссоциации клеток монослоя трипсином и разведения, т.е. пересеяна или субкультивирована.

Для суспензионных культур в случае субкультивирования достаточно только разведения.

Диссоциация клеток монослойной культуры достигается промыванием монослоя фосфатным солевым буфером (ФСБ) или ФСБ с 1 мМ этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) и последующей инкубацией с раствором трипсина (0,25%-ный неочищенный или 0,01- 0,025%-ный очищенный) в течение 15 мин.

После этого трипсин удаляется, клетки суспендируют в среде, определяют их количество и рассевают в новые флаконы

Как определить, что клеточную культуру пора рассевать?

• клетки образуют плотный монослой;

• индикатор-краситель меняет цвет (например, индикаторный краситель феноловый красный меняет цвет с ярко-красного в свежей среде до желто-оранжевого в среде с культивируемыми в течение некоторого времени клетками)

Некоторые быстроделящиеся клетки требуют смены среды после 3 - 4 суток культивирования. Однако клетки можно приучить к более длительному культивированию без замены среды или пересева. Для этого можно уменьшить содержание в среде сыворотки (до 4 - 5%) или рассевать клетки в соотношении 1/5 - 1/6, но не ниже допустимого предела концентрации. Для фибробластов, например, такая критическая концентрация равняется приблизительно 300-350 тыс. клеток/мл.

5.Обогащение и очистка клеточных препаратов. Иммуноселекция, селективное культивирование

Одна из важных проблем - это сохранение специфических типов клеток и их свойств, т.к. культуры клеток часто могут «загрязняться» неспециализированными клетками, а также клетками «неправильных» линий.

Традиционный подход к решению проблемы гетерогенности популяции – это выделение чистого клеточного штамма путем клонирования (т.е. мы размножаем 1 тип клеток, который нм нужен). Этот метод применяют как для постоянных клеточных линий, так и в отношении первичных культур (хотя второе часто не очень эффективно). Хотя клонирование первичных культур достаточно эффективно для юкстагломерулярных и гломерулярных клеток, клеток почек, овалоцитов из печени и др.

Клонирование прикрепленных культур может вестись в чашках Петри, многолуночных планшетах, флаконах, при этом можно легко различить отдельные колонии. Важно удостовериться, что клоны произошли из единственной клетки (той, которая нам нужна), это можно сделать по морфологии клеток и по их функциям. Клонирование также может проводиться в суспензии, когда клетки сеют в гель (агар, агароза, вязкий раствор метилцеллюлозы с агаровой или агарозной подложкой). При таких условиях дочерние клетки не отрываются от колонии и колонии не смешиваются, и это не мешает правильно оценить эффективность посева. Гематопоэтические клетки клонируют в суспензии.

Трансформированные клетки обычно имеют высокую эффективность посева в монослое и суспензии, в отличие от нормальных клеток, которые в суспензии клонируются не очень хорошо из-за потребности прикрепления к субстрату для пролиферации. С помощью этого различия можно изучать наличие и степень трансформации.

Наиболее широко используют клонирование с разведением. При этом клетки, разведенные до определенной плотности, формируют отдельные колонии.

Однако поскольку клетки посеяны в низкой концентрации, степень их выживания довольно низкая из-за того, что для нормального деления нужно влияние других клеток популяции или ткани. Эффективность посева пытались улучшить исходя из предположения, что клеткам при низкой концентрации нужно больше питательных веществ из-за их утечки через мембрану. Также в культурах с низкой плотностью отсутствуют сигнальные молекулы или факторы кондиционирования (так называют вещество, стимулирующее деление отдельных клеток). Поэтоу разработали капиллярный метод, при котором в капилляре клеткам создается локальное микроокружение, которое напоминает суспензию с высокой концентрацией. Позже разработали микрокапельный метод, при котором клетки сеяли в микрокапле под жидкий парафин, что позволяло создавать высокую концентрацию клеток, при этом колонии формировались отдельно друг от друга.

Итак, для лучшего роста колоний надо брать богатые питательными веществами среды (среда Хэма F12 или оптимизированные среды для определенного типа клеток – MCDB 302 для СНО). Также нужно регулировать содержание СО2 (обычно это 5%, но например для клеток глии и фибробластов лучше 2%). Также важно добавлять различные гормоны (дексаметазон для клеток глии человека, фибробластов, глиомы, меланомы и др). Еще можно использовать кондиционированные среды. Это среды, которые использовались для роста других клеток (3Т3, фибробласты мышиного эмбриона, та же самая клеточная культура), они содержат метаболиты, факторы роста и продукты матрикса, оставшиеся от этих клеток. Эти среды добавляют в обычные, и этот прием может повысить эффективность посева клеток.

Так же для того, чтобы вырастить клетки при низких плотностях используют фидерные слои. Они имитируют условия окружающей среды, дают питательные вещества, факторы роста и компоненты матрикса. Можно использовать в качестве фидерных клеток гомологичные клетки, но лучше гетерологичные, т.к. при выделении нужного клона легче исключить случайную контаминацию фидерными клетками. Обычно используют культуры клеток 3T3, MRC-5, STO.

Когда клонирование используется для селекции специфических штаммов клеток, то формируемые колонии должны быть изолированы для дальнейшего размножения. Если клонирование ведется на чашках Петри, то разделение колоний осуществляют удалением среды и помещением нержавеющих или керамических колец вокруг нужных колоний. Также можно экранировать одну колонию при помощи свинцового диска, а остальное облучить. Если клонирование ведется в многолуночных планшетах, то изолировать колонии можно трипсинизацией отдельных ячеек. Выделять колонии в суспензии проще, но для этого нужна препаровальная лупа.

Селективное культивирование

1.Селективное культивирование можно обеспечить с помощью специализированных сред для специфических типов клеток. Бессывороточные среды специального состава были разработаны для культивирования фибробластов человека, опухолевых клеток человека и мыши, лимфобластоидных линий клеток и др. Они отличаются по составу и содержанию таких компонентов как аминокислоты, витамины, антиоксиданты, неорг соли, микроэлементы, липиды, факторы роста, гормоны и другие добавки, т.к. у разных клеток разные пищевые потребности.

Это одно из основных преимуществ бессывороточных сред – возможность приготовления селективных сред для индивидуальных типов клеток. Их куча, и они коммерчески доступны.

2. Использование селективных ингибиторов

Например, в культуральной среде заместили L-валин на D-валин. При этом на среде стали расти клетки, у которых есть D-аминокислотная оксидаза. Так выделили клетки эпителия почечных канальцев, эпителия молочной железы коровы, эндотелиальные клетки крысиного мозга.

Для подавления избыточного роста фибробластов сначала использовали cis-OH-пролин (хотя он и токсичен для других клеток), потом обнаружили, что фенилэтилбарбитуровая кислота ингибирует рост фибробластов в культуре гепатоцитов, потом в культуре панкреатических клеток снизили их рост за счет этилмеркуртиосалицилата натрия. Они также чувствительны к генетицину (в концентрации 100 мкг на мл). Затем открыли перспективный метод – разработали моноклональные антитела к стромальным клеткам карциномы молочной железы человека. Вместе с комплементом эти антитела токсичны для фибробластов из различных опухолей, т.о. можно выделить линии клеток злокачественных опухолей. Также клетки можно селективно убивать конъюгатами антител с токсинами или фарм соединениями.

Трансфецированные клетки отбирают по резистентности к антибиотикам (неомицин, генетицин, гидромицин, метотрексат), включая в генетические конструкции для трансфекции гены устойчивости к антибиотикам. Таким образом, можно проводить селекцию стабильных трансфектантов. А можно проводить негативную селекцию при помощи ТК-гена вируса простого герпеса, который переводит ганцикловир в токсичный продукт. Тогда трансфецированные клетки погибнут.

Если в смеси клеток разная чувствительность к факторам роста, то можно стимулировать фактором роста один тип клеток, и, поскольку растущие клетки более чувствительны, уничтожить их облучением или арабинозида цитозином.

3.Получени мутантных клеточных линий, которые амплифицируют ген дигидрофолатредуктазы.

Если клетки подвергать воздействию ступенчато возрастающей концентрации метотрексата (антагонист фолиевой кислоты), то они приобретают устойчивость к токсическим свойствам этого препарата. Это происходит из-за амплификации гена дигидрофолатредуктазы.

Аналогично можно создать устойчивость к антибиотикам, другим антиметаболитам, токсичным металлам и др.

4.Селективная адгезия

Разные типы клеток обладают разной степенью связывания с субстратом и прикрепляются с разной скоростью. Если первичную суспензионную культуру посеять во флакон и перенести во второй флакон через 30 мин, а затем в третий через час и т.д. до 24 часов, то хорошо прикрепляющиеся клетки будут в первом флаконе, а наименее способные к прикреплению в последнем. Например, макрофаги чаще остаются в первом сосуде, фибробласты в следующих нескольких, эпителиальные клетки в следующих нескольких, а гематопоэтические в последнем.

Если в среде для первичной дизаггрегации тканей используют коллагеназу, то большинство высвобождаемых клеток не будет прикрепляться в течение 48 часов, если не удалять коллагеназу. Но не макрофаги, они мигрируют из фрагментов ткани и прикрепляются даже в присутствии этого фермента. Так их можно отделить. Этот метод используют при дезаггрегации биопсийных образцов опухолей человека.

5.Селективное открепление

При действии трипсина или коллагеназы одни клетки открепляются быстрее других. Наример, периодическая быстрая обработка трипсином удалит фибробласты из культуры фетального кишечника человека и кожи. Также действие коллагеназы на культуру клеток молочной железы в течение нескольких дней приводит к удалению фибробластов, а эпителиальные клетки остаются. А добавление ЭДТА приводит к высвобождению эпителиальных клеток быстрее, чем фибробластов.

6.Природа субстрата

Сейчас лучше изучено действие составных частей среды на селекцию клеток, однако смесь различных коллагенов с протеогликанами, ламинином и другими протеинами матрикса также можно использовать для создания селективных субстратов. Например, известно, что пролиферации эпителиальных клеток способствует коллаген, а дифференцировке и выживанию – матригель (это особая желатинообразная питательная среда, смесь белков, секретируемых клетками саркомы мыши). Также можно использовать пластиковую посуду Primaria (фирма BD Biosciences), имеющую заряд на поверхности. Она способствует улучшению роста эпителиальных клеток по сравнению с фибробластами. BD Biosciences также производит пластик, покрытый синтетическим или природным матриксом, который может облегчать рост требовательных типов клеток, хотя и не очень селективно.

7.Селективные фидерные слои

Для селективного роста эпидермальных клеток можно использовать фидерные слои, также они полезны для сдерживания сверхроста стромальных элементов в культуре клеток молочной железы и карциномы толстой кишки. Фидерный слой обеспечивает не только внеклеточный матрикс для адгезии эпителия, но также предоставлять питательные вещества, факторы роста и компоненты матрикса, способствующие выживанию клеток (чаще используют культуры клеток 3T3, MRC-5, STO). Например, человеческая глиома будет расти на фидерных слоях нормальной глии, в отличие от клеток, полученных из нормального мозга.

8.Селекция на полужидкой среде

Трансформация многих культур фибробластов снижает зависимость клеточной пролиферации от субстрата. Т.о. можно отделять трансформированные клетки от нормальных (нормальные не будут образовывать колонии в суспензии).

Если по каким-то причинам нельзя создать условия для селекции, то возникает необходимость прибегнуть к физическим или иммунологическим методам разделения клеток. Наиболее эффективные методики разделения клеток основаны на различиях в 1. Плотности клеток, 2. Размере клеток, 3. Аффинности антител к эпитопам на клеточной поверхности, 4. Светорассеянии или флюоресценции при сортировке с помощью проточной цитометрии.

1.Плотность клеток и изопикническая седиментация

Разделение по плотности проводят центрифугированием при низких значениях g. В градиенте плотности клетки оседают до равновесного уровня, на котором плотность среды равна их собственной плотности (изопикническая седиментация). Среда должна быть нетоксичная и невязкая. Часто используют перколл (коллоидный кремний) и рентгеноконтрастные йодированные соединения метризамид и метризоат, из которых специально делают градиент, а потом наслаивают клетки.

2.На осаждение клеток влияет их размер. Наслаивание клеток в градиенте позволяет хорошо разделять клетки, только если они значительно отличаются по размеру, и каждая популяция гомогенна по размеру.

3.Существует ряд методик, основанных на специфическом связывании антитела с клеточной поверхностью. Их эффективность зависит от специфичности выбранных антител и доступности эпитопов на поверхности клеток.

- Иммунный лизис (использование антител к нежелательным клеткам).

- Направленная доставка цитотоксина с помощью антите

- Иммунный пэннинг. Основан на прикреплении клеток к чашкам Петри с сорбированными антителами. При этом клетки, к которым специфичны антитела, быстро прикрепляются ко дну чашки, остальное смывают. Бывает положительный иммунный пэннинг (собираем нужные клетки на антитела, а потом собираем с помощью механической обработки или мягкой трипсинизации), так и отрицательный (удаляем ненужные клетки).

- Магнитный сорсинг. Специфические антитела иммобилизованы на ферритиновых гранулах. Клеточную суспензию смешивают с гранулами и помещают в магнитное поле, тогда нужные клетки на гранулах перемещаются к боковой стенке камеры для разделения. После отключения тока клетки отделяют от гранул с помощью трипсинизации или интенсивного пипетирования. Еще один вариант – клетки сорбируются на антителах микропарамагнитных гранул, которые могут связываться с ферромагнитными шариками разделительной колонки при внесении в магнитное поле. Этим методом разделяют многие клетки, в т.ч. стволовые, очищают костный мозг от клеток лейкемии и выделяют эпителий почечных канальцев. Плюс метода с микрогранулами – можно продолжать культивировать и продолжать сортировать клетки без удаления гранул.

4.Флуоресцентно-активируемый клеточный сорсинг

Р азделение клеток с помощью флуоресценции основано на прохождении клеток через лазерный луч, улавливании и регистрации светорассеяния. При этом клетки должны быть обработаны флуоресцентным красителем (йодистый пропидий, хромомицин А3 для окрашивания ДНК) или антителами, мечеными флуорохромом. Прибор – проточный цитометр. Клетки поступают сверху, создается ламинарный поток. Поток клеток выходит из ячейки, его пересекает лазерный луч, генерируется сигнал, который приводит в действие заряженный электрод, при этом потом клеток заряжается. Далее вибрационный излучатель разбивает поток на капли, которые несут заряд и т.о. отклоняются электродными пластинами, которые находятся ниже проточной ячейки.

Таким образом, все клетки со сходными свойствами собираются в одну пробирку. Условие метода – клетки должны различаться по светорассеянию (размер клетки) или флуоресценции (содержание РНК, ДНК или белка, наличие специфических антигенов и др). Широко используют для гематопоэтических клеток.

5. Еще популярные методы для разделения: электрофорез, аффинная хроматография, противоточное распределение.