3.3 Определение антигенсвязывающих параметров антитела scFv4d5 с рецептором her2/neu на поверхности опухолевых клеток.
Двухдоменный фрагмент scFv4D5 терапевтического антитела 4D5 канонического строения сохраняет антигенную специфичность в отношении клеточного рецептора HER2/neu по данным цитофлуориметрического анализа. Связывание ФИТЦ-меченого антитела scFv4D5 исследовали на клетках с высоким уровнем экспрессии HER2/neu (клетки SKBR3). В качестве условно отрицательного контроля использовали клетки MDA-MB-231, имеющие низкий уровень экспрессии рецептора HER2/neu. Связывание с этой линией клеток принимали за неспецифическое, отражающее фоновое взаимодействие с клеточной мембраной любых клеток.
Показано, что
взаимодействие антитела scFv4D5
с высокоэкспрессирующими клетками
SKBR3 имеет вид насыщаемого
и, следовательно, специфического
связывания и высокие величины
флуоресцентных сигналов (рис. 3.5).
В то же время с клетками линии MDA-MB-231
связывание имеет фоновый и ненасыщаемый
(линейный) характер с низким уровнем
сигналов
Рисунок 3.5 - Связывание меченного флуоресцеином белка scFv4D5 (Flu-scFv4D5) с рецептором HER2/neu
1. - Связывание меченного флуоресцеином белка scFv4D5 (Flu-scFv4D5) с рецептором HER2/neu на поверхности клеток SKBR3 с высоким уровнем экспрессии рецептора; 2. - Связывание меченного флуоресцеином белка scFv4D5 (Flu-scFv4D5) с рецептором HER2/neu на поверхности клеток MDA-MB-231 с низким уровнем экспрессии рецептора HER2/neu; 3. - кривая получена вычитанием сигналов кривой 2 из кривой 1 и отражает вклад специфического связывания антитела scFv4D5 с HER2/neu
Оцененная по концентрации полунасыщения константа диссоциации имеет величину ~ 5•10-8 М. Эта величина выше, чем Кd полноразмерного гуманизированного антитела 4D5 (трастузумаба) - Кd = 5•10-9 М., что означает на порядок меньшую антигенсвязывающую активность. Этот результат отражает известную тенденцию к снижению константы связывания (аффинности) при структурной редукции молекулы антитела до двух вариабельных доменов в составе одной полипептидной цепи. Дополнительным фактором, создающим тенденцию к снижению результатов определения аффинности антитела scFv4D5, является неравновесный характер процесса перед измерением в цитофлуориметре, создающий условия для диссоциации части комплексов на стадиях отмывки клеток от несвязавшегося антитела перед измерением.
Все перечисленные факторы снижения аффинности являются «стандартными» для данной категории экспериментальных измерений. Созданная экспериментальная система анализа и реагенты для количественной оценки связывания с рецептором HER2/neu методом проточной цитофлуориметрии представляет собой приемлемую основу для сравнительного анализа структурных вариантов HER2/neu-специфичных антител.
3.4 Определение антигенсвязывающей активности vhh антител
Методом
проточной цитофлуориметрии с применением
линии HER2/neu-экспрессирующих
клеток SKBR3
и меченных изотиоцианатом флуоресцеина
белков VHH-seg4
оценена равновесная константа связывания
с рецептором HER2/neu.
Рисунок 3.6 - Определение константы связывания наноантитела 2D3, меченного изотиоцианатом флуоресцеина, с рецептором HER2/neu на поверхности клеток SKBR3. Справа – результат анализа кривой насыщения; слева - результат анализа кривой насыщения в координатах двойных обратных величин.
Была получена величина Кd для последовательности наноантитела равная 5•10-7 М при степени модификации 1,1 моль флуоресцеина на 1 моль белка (рисунок 3.6). Эти величины констант связывания близки к величинам, полученным для канонического антитела scFv4D5. Эти данные свидетельствуют о близкой функциональной эффективности антигенсвязывающих доменов неканонических и канонических антител.
Антигенсвязывающая активность в терминах констант диссоциации (Кd) имеет порядок 10-8 М и весьма близка или идентична для обоих групп рассмотренных антител. Однако эта идентичность имеет разную структурную основу. Для двухдоменного scFv фрагмента канонического антитела 4D5 потеря аффинности при структурной редукции от полноразмерного «родительского» антитела (Кd порядка 10-10 М) происходит на порядок или более (~10-50-кратное снижение). Напротив, для неканонических антител функциональная автономность антигенсвязывающего домена (отсутствие легкой цепи и партнерских взаимодействий соседних доменов) приводит к изначально сниженной аффинности полноразмерной структуры. Однако эта аффинность фактически не уменьшается при редукции до однодоменной структуры, что является прямым следствием уникальной автономности доменов неканонических антител.