Глава 2 материалы и методы исследования
2.1 Использованные реагенты
В работе использованы следующие реагенты: мочевина («хч»); Ni-NTA-Sepharose (“Qiagen”, США); имидазол (“Merck”, ФРГ); Кумасси R-250 (Sigma); бактериальный агар; трис-основание (Sigma); акриламид, бисакриламид, додецилсульфат натрия; β-меркаптоэтанол (“Bio-Rad”, США); триптон; дрожжевой экстракт (“BioMeriaux”, Франция); гуанидингидрохлорид (ГГХ), изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (ИПТГ); агароза для гель-электрофореза "Lonza", белковые стандарты молекулярных масс ("Serva", Германия; "Amersham", США; "Sigma", США), нуклеиновые стандарты молекулярных масс ("Serva", Германия; "Amersham", США; "Sigma", США), набор реагентов TransformAidTM Bacterial Transformation Kit (Fermentas, Литва), набор реагентов DNA Purification System (Promega, США), рестриктазы Not I и Nde I (Fermentas, Литва), Т4 ДНК лигаза (Fermentas, Литва), питательная среда LB.
2.2 Штаммы бактерий и плазмиды
Бактерии E.coli BL21 (DE-3) B F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal, источник штамма: «Stratagene»
В данном штамме бактерий отсутствует lon и ompT протеазы что предотвращает расщепление рекомбинантного белка.
Отличительной особенностью генома штамма E.coli BL21, использованного в настоящей работе для создания экспрессионной системы, является наличие интегрированного гена Т7 РНК-полимеразы под контролем промотора lacZ. Таким образом, при росте клеток на богатых средах, содержащих в том числе и глюкозу, транскрипция Т7-полимеразы подавлена. При истощении же глюкозы и добавлении ИПТГ происходит индукция полимеразы и транскрипция с соответствующих ей промоторов. В данном случае транскрипция индуцируется с промотора экспрессионного вектора pET23d.
Плазмида pET23d-scFv4D5
Плазмида сконструирована на основе вектора pET-23d+ в лаборатории молекулярной иммунологии Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Москва) под руководством член-корреспондента РАН. С.М. Деева и передана лаборатории рекомбинантных белков для проведения совместных работ в рамках долговременной программы научной кооперации двух лабораторий.
Аминокислотная последовательность вставки, кодирующей белок scFv4D5-6His:
MIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYS ASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQ GTKVELKRATPSHNSHQVPSAGGPTANSGEVKLVESGGGLVQPGGSLRLS CATSGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTIS ADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWG QGTTVTVSSEFPKPSTPPGSSGGAPHHHHH
Подчеркнутая
полипептидная последовательность в
виде части шарнирного участка мышиного
IgG3 (murine IgG3 hinge), добавленная в С-концевую
часть структуры для большей доступности
гистидинового «тэга» 
металл-хелатному
сорбенту Ni-NTA-Sepharose 4B.
Выбор структур VHH доменов с антигенной направленностью анти-cErbB2
Рисунок 2.1 - Плазмида pUC57:: Nb2D3
Из набора первичных структур VHH доменов неканонических верблюжьих антител [44], была выбрана последовательность 2D3. Критерием выбора служили: 1) максимальное совпадение с наиболее часто встречаемой последовательностью аминокислот в каркасной (framework) области VHH доменов и 2) высокие значения констант связывания антигена c-ErbB2 (определены методом плазмонного резонанса на приборе семейства BIAcore).
Длина исходной последовательности VHH составляла: 123 аминокислоты. С учетом добавленного N-концевого Met и гексагистидинового пептида на С-конце первичная структура VHH домена включает 130 аминокислот.
2D3
MEVQLVESGGSLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQVPGKGLEWVSSINWSGTHTDYADSVKGRFTISRNNANNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNWRDAGTTWFEKSGSAGQGTQVTVSSHHHHHH