Рабочие материалы по теме: «Гистологическая техника: окраска гематоксилином-эозином свободноплавающих срезов.»
ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ.
С тех пор как было установлено, что отдельные составные части клеток и межклеточные элементы по-разному воспринимают и удерживают определенные красители, было предложено (и предлагается до сих пор) огромное количество методов окрашивания гистологических препаратов. Несмотря на то, что окрашивание срезов имеет давнюю историю, до настоящего времени полностью не ясна сущность механизмов действия многих красителей. Из физических факторов в первую очередь следует отметить явления диффузии (проникновение), адсорбции (поверхностное впитывание) и абсорбции (глубокое пропитывание) красителя, а также его растворимость, из химических — электролитические свойства красящих растворов и самих тканей. Немаловажное значение имеют плотность тканей и дисперсность самого красителя. Первое свойство определяет последовательность окраски отдельных структур, второе— скорость процесса окраски.
Именно на электролитических свойствах основано разделение применяемых в гистологической практике красителей на три группы: основные, кислотные и нейтральные.
Основной краситель представляет собой красящее основание или его соль и окрашивает клеточные и тканевые структуры кислой природы, например хроматин ядра, содержащий ДНК, и ядрышко, содержащее РНК. Отсюда и термин базофилия (любящий основание) для обозначения тканевых компонентов, окрашивающихся основными красителями (тионин, гаматоксилин, метиловый зеленый и др.).
Кислотный краситель — это красящая кислота или ее соль, в силу чего она окрашивает вещества и частицы основной природы, например гранулы эози-нофильных лейкоцитов, цитоплазму некоторых клеток передней доли гипофиза и др. Отсюда и термин о к с и ф и л и я (ацидофильный— любящий кислоту) для тканевых элементов, красящихся кислотными красителями. В эту группу веществ входят эозин, эритрозин, кислотный фуксин, конго красный и др.
Нейтральный краситель образуется при соединении водных растворов кис-лотного и основного красителей (соединение красящей кислоты с красящим основанием). К этой группе относятся судан III, эозиновокислый метилено-вый синий и др.
Не следует путать нейтральный краситель с нейтральной красящей смесью, для которой характерно одновременное присутствие в растворе основного и кислотного красителей. Термин же н е й т р о ф и л и я применим к резуль-татам окраски обеими группами красителей, так как отражает не свойство красителя, а равновесие между кислотными и основными свойствами окра-шиваемых элементов.
С
ледует
помнить,
что
на
качество
окраски
и
ее
стойкость
значительное
вли-яние
могут
оказывать
способ
фиксации,
предварительная
и
последующая
обработка
препаратов.
Поэтому
нужно
строго
соблюдать
все
методические
указания
и
общие
правила
окраски.
Подавляющее большинство гистологических красителей не специфично, т. е. не раскрывает химическую природу тканевых компонентов. С их помощью можно изучать лишь морфологические особенности микроструктур. Именно отсутствие специфичности и послужило стимулом для разработки нового направления — гистохимических методов исследования, в основу которых были положены специфичные химические реакции между красителями и веществами, входящими в состав тканевых элементов Красители, применяемые для гистологических целей, бывают природные и искусственные.
Различают несколько типов гистологической окраски: прогрессивный, регрессивный, прямой, непрямой, простой и сложный.
Прогрессивное окрашивание — это такой способ, при котором срезы находятся в красителе до тех пор, пока не достигнут требуемого уровня окрашиваемости.
Регрессивное — когда срезы вначале перекрашивают, а затем доводят до требуемой окраски путем отмывания в соответствующей жидкости, что позволяет более отчетливо выделить отдельные элементы тканей.
Следует постоянно помнить:
а) о тщательном удалении отмывающей жидкости (в противном случае она будет продолжать действовать и исказит результат окраски);
б) о предпочтительном применении тонких срезов перед толстыми;
в) о том, что разведенные красители дают лучшие результаты, чем крепкие растворы (толстые срезы и высокая концентрация красителя затрудняют дифференцировку и приводят к неравномерной окраске срезов);
г) о том, что окраска должна вестись под контролем микроскопа.
Применение регрессивных методов окраски требует определенного навыка, который приобретается постепенно.
Прямая окраска — окрашивание объекта непосредственно в растворе красителя, непрямая (протравная) — когда срез окрашивают нужным красителем лишь после предварительной обработки специальными протравными красителями.
При простой окраске применяют один краситель. Сложная окраска предус-матривает обработку препарата несколькими красителями (двумя и более) одновременно или последовательно (см. окраска гематоксилин-эозином, окрашивание по методу ван - Гизона).
Все методы гистологического окрашивания можно разделить на две основные группы:
а) обзорные, используемые для получения общего ориентировочного представления об изучаемом объекте (окрашиваются преимущественно ядра и цитоплазма клеток);
б) специальные, применение которых позволяет окрашивать именно те тканевые и клеточные элементы, которые интересуют исследователя (органоиды клетки, волокнистые структуры и т. п.). Методы, составляющие вторую группу, более сложные и требуют особых способов фиксации.
Для того чтобы получить хорошие результаты при любом методе окраски гистологических препаратов, необходимо соблюдать определенные правила:
1. Красящие растворы должны быть чистыми, для чего любой краситель необходимо перед употреблением отфильтровать, а водный раствор готовить только на дистиллированной воде.
2. Отдавать предпочтение: а) окрашиванию красителями низкой концентра-ции в течение длительного времени перед кратковременной окраской кра-сителями высокой концентрации; б) применению регрессивных методов.
3. Тщательно соблюдать все процедуры подготовки среза к окраске и после-дующей его обработки.
3 а м о р о ж е н н ы е срез ы не нуждаются в предварительной обработке, так как обычно при резке их собирают в дистиллированную воду.
Предварительной обработке и последующей окраске можно подвергать как наклеенные па предметные стекла, так и свободноплавающие срезы.
рис.1.
Расположение
стекол
со
срезами
в
биологическом
стеканчике.
В первом случае употребляют биологические стаканчики, специальные
кюветы, высокие бюксы. Для того чтобы увеличить пропускную способность, стекла со срезами складывают попарно стороной, не несущей срез (спинкой), друг к другу и располагают в виде треугольника (рис. 1 ) или (в более просторном сосуде) укладывают пары друг за другом, разделяя их с помощью различных приспособлений (изогнутые стеклянные или металлические пластинки и т. д.). Для работы со свободноплавающими срезами применяют часовые стекла, низкие бюксы или чашечки. Ненаклеенные срезы переносят из одной посуды в другую с помощью стеклянного (или металлического) крючочка или шпателя, а стекла — пинцетом. Посуда должна быть четко этикетирована и расставлена в определенном порядке, обеспечивающем нужную последовательность работы. При переносе срезов из одного раствора в другой необходимо следить за тем, чтобы последующая порция жидкости как можно меньше загрязнялась предыдущей (особенно при перемещении из ксилола в спирт). Для этого при переносе предметных стекол и свободноплавающих срезов стараются обеспечить максимальное стекание жидкости, следя одновременно за тем, чтобы срез не подсох (высыхание заметно по побелению среза). Предметные стекла, сложенные попарно, необходимо разъединять и быстро просушивать обратную сторону фильтровальной бумагой или тряпочкой, следя за тем, чтобы не перепутать стороны. Следует также быть внимательным при опускании и извлечении стекол со срезами, ибо при этом можно поцарапать срезы. Необходимо своевременно менять растворы, не допуская их чрезмерного загрязнения.
Проведение окраски. При окраске водными красителями срезы переносят из дистиллированной воды, а при окраске спиртовыми — из спирта соответст-вующей концентрации непосредственно в красящий раствор (прямое окрашивание) или сначала в жидкость для протравки (непрямое окрашивание). Когда препарат приобретает нужную интенсивность окраски, его промывают в воде (или спирте) с целью удаления избытка красителя, а затем, если нужно, дифференцируют в соответствующей жидкости. Излишний краситель отмывают до тех пор, пока краска не перестанет переходить из среза в отмывающую жидкость.
Процедуру окраски срезов, наклеенных на стекла, можно проводить путем как помещения последних в красящий раствор, так и накалывания красителя на срез. В первом случае применяют стеклянные стаканчики, кюветы или специальные металлические стойки, позволяющие одновременно окрашивать большое количество (до 1О—50) стекол . Для окрашивания накалыванием в плоские чашки или ванночки кладут параллельно стеклянные палочки, на которые укладывают предметные стекла. Для того чтобы палочки не смеща-лись, концы их соединяют резиновой трубкой . После этого на срез с помо-щью пипетки накапывают раствор красителя. Если окрашивание требует дли-тельного времени, то во избежание испарений красителя место расположения среза накрывают маленьким часовым стеклом или чашечкой Подобный эф-фект можно получить, поместив предметные стекла с накапанной краской в чашку Петри, одновременно положив рядом смоченную в воде вату. После того как чашка будет закрыта, происходит увлажнение воздуха, ведущее к значительному уменьшению испарения красящего раствора. Окрашивание свободноплавающих срезов, как и при предварительной подготовке, ведут в бюксах или на часовых стеклах.
Рис
2. Приспособление
для
одномоментной
обработки
большого
количества
стекол
со
срезами.
Рис.
3. Приспособление
для
размещения
стекол
со
срезами
при
накалывании
красителя.
Рис.
4. Заключение
гистологических
срезов.
Заключение срезов. Для обезвоженных и просветленных препаратов наиболее часто применяемой средой заключения является бальзам, представляющий собой прозрачную, желтоватого цвета древесную смолу. Бальзам обладает консервирующими свойствами, сохраняет прозрачность препарата и имеет показатель преломления, близкий к показателям преломления стекла. В последнем свойстве легко убедиться, взглянув на стеклянную палочку, погруженную в бальзам (часть, находящаяся в смоле, почти не видна). Различают два вида бальзама — канадский и пихтовый. Способ приготовления их одинаков: кусок (или куски) затвердевшей смолы помещают в чистую сухую широкогорлую стеклянную банку и, залив ксилолом (или толуолом), ставят в термостат. Обычно приготовляют раствор жидкой консистенции, который фильтруют и оставляют в открытом сосуде (желательно в вытяжном шкафу). Когда консистенция его будет напоминать жидкий мед, раствор готов к употреблению. Обычно бальзам имеет слабокислую реакцию. В тех случаях, когда кислая среда действует на окраску неблагоприятно, необходимо применять нейтральный бальзам, который получают путем добавления небольшого количества порошка углекислого калия или натрия. Хранят бальзам в специальных широкогорлых склянках, закрывающихся притертыми колпачками, шлиф которых смазывают тонким слоем вазелина. Если нет специальной склянки, можно использовать небольшой широкогорлый флакон из-под лекарств, закрывающийся эластичной хлорвиниловой пробкой. В центре пробки делают отверстие и вставляют в него стеклянную палочку, при помощи которой и извлекают бальзам.
Методика. Вынув стекло со срезом из ксилола, быстро вытирают тыльную сторону и, положив в горизонтальном положении на стол (или какую-нибудь плоскую подставку), наносят несколько капель бальзама. Затем берут приготовленное покровное стекло (чистым пинцетом или осторожно двумя пальцами за боковые края, чтобы не загрязнить поверхность), ставят его на предметное стекло рядом с препаратом под углом 45° и, как только бальзам растечется по краю покровного стекла, его потихоньку опускают. При этом воздух постепенно вытесняется и бальзам покрывает препарат тонким, равномерным слоем. Покровные стекла нужно подготовить заранее. Помимо того что они должны быть абсолютно чистыми, их следует рассортировать на толстые и тонкие. Если окрашиваемый препарат предполагают исследовать с применением иммерсионного объектива, то его нельзя заключать под толстое покровное стекло, так как фокусное расстояние объектива окажется меньшим, чем общая толщина заключенного препарата, и фокусировка не будет достигнута. Количество бальзама нужно рассчитать таким образом, чтобы его хватило только на покрытие всей площади под покровным стеклом. Если бальзама мало, то останется свободное пространство между стеклами, если много, раствор растечется по предметному стеклу и испачкает его. В первом случае нужно нанести каплю бальзама на предметное стекло у того края покровного стекла, под которым остался воздух, и он заполнит пустоту. Если бальзам вытек из-под покровного стекла, его нужно тут же стереть тряпочкой, слегка смоченной в ксилоле. Заключенный препарат помещают на специальный планшет и кладут на покровное стекло груз на 24 часа для расправления. Если нужно сильно прижать (значительная неровность поверхности препарата), то применяют бельевые зажимы. Препарат должен находиться в горизонтальном положении не меньше 24 часов. После того как бальзам загустеет, препарату можно придавать любое положение.
рис.
5. Вид
гистологического
архива.
.
рис.
6. Вид
ящика
с
гистологическими
препаратами
для
длительного
хранения.
Хранить гистологические препараты следует защищенными от пыли и света. Наиболее целесообразный способ хранение в специальных коробках с зубчатыми рейками. Хорошо высушенные препараты можно держать и в обычных картонных коробках. В этих случаях стекла складывают попарно спинками и каждую пару отделяют от последующей горизонтальной полоской плотной бумаги, не выступающей за край стекла. Для того чтобы легче было ориентироваться, отдельные группы препаратов разделяют более широкими полосками и на выступающий над стеклами край наносят нужные обозначения (такие же разделители рекомендуется вкладывать в специальные коробки). Необходимые пометки делают и на наружной поверхности боковых стенок коробок.
Возможные погрешности при заключении:
а) весь препарат покрыт мельчайшими пылевидными капельками (недостаточное обезвоживание). Сменить растворы, увеличить время обезвоживания;
б) под стеклом разнокалиберные подвижные пузырьки (при заключении попал воздух). Если пузырьки расположены над препаратом и при легком надавливании препаровальной иглой на покровное стекло не исчезают, необходимо перезаключить препарат. Для этого стекло с препаратом погружают в ксилол и держат до тех пор, пока покровное стекло сползет само или легко поддастся смещению препаровальной иглой;
в) препарат пересекают бесструктурные или зубчатые объемные волоконца, на срезе расположены различные включения (загрязнение препарата в процессе проводки через растворы, загрязнен бальзам или же плохо очищено покровное стекло). Фильтруют растворы, тщательно протирают покровные стекла.
КОНТЕЙНЕРЫ И СТОЙКИ ДЛЯ ОКРАСКИ МИКРОПРКПАРАТОВ. «РУЧНОЕ» ОКРАШИВАНИЕ.
ГИСТОСТЕЙНЕР ДЛЯ ОБРАБОТКИ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ГИСТОХИМИЧЕСКИМИ ИЛИ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕССКИМИ МЕТОДАМИ.
В настоящее время гистохимия перешла на количественный уровень исследования с применением специальных приборов (цитоспектрофотометров), позволяющих довольно точно определять количественную характеристику интенсивности окраски (продукта реакции), что особенно важно для оценки состояния метаболизма в исследуемых органах, тканях и отдельных клетках.
Это еще в большей степени предъявляет повышенные требования к качеству проведения гистохимических реакций и соблюдению строгой стандартизации обработки сравниваемых объектов на всех этапах.
Именно в этих целях в первую очередь применяют совмещение сравниваемых образцов в одном блоке с последующим получением срезов одинаковой толщины на одном стекле.
Когда это сделать невозможно, необходимо в ходе резки располагать разные срезы на одном предметном стекле.
При любом способе совмещения сравниваемые срезы следует подвергать всем этапам гистохимических реакций одновременно, используя одни и те же порции реактивов.
Цитохимия, раздел цитологии, изучающий химическую природу клеточных структур, распределение химических соединений внутри клетки и их превращения в связи с функцией клетки и её отдельных компонентов.
ЦИТОХИМИЯ возникла в 20-х гг. 19 в. благодаря работам главным образом французского ботаника Ф. В. Распая, суммировавшего представления о ЦИТОХИМИИ в книге "Очерки микроскопической химии в применении к физиологии" (1830).
В дальнейшем были разработаны методы цитохимического окрашивания (для наблюдения под микроскопом) углеводов, белков, аминокислот, минеральных соединений, липидов. Значительным прогрессом для ЦИТОХИМИИ явилось применение анилиновых красителей (конец 19 — начало 20 вв.).
Основной методический подход ЦИТОХИМИИ — проведение соответствующих химических реакций в гистологических препаратах и их оценка под микроскопом.
Оценка может быть качественной (визуальной) или количественной — с помощью методов цитофотометрии, авторадиографии и др.
За последние годы интенсивно развиваются электронно-микроскопическая (ультраструктурная)
Цитохимия и иммуноцитохимия. К методам ЦИТОХИМИИ относятся также микрохимические, позволяющие иссекать и исследовать отдельные клетки, и центрифугирование, позволяющее получать из ткани фракции, обогащенные определёнными видами клеток или субклеточных структур: ядрами, митохондриями, микросомами, цитоплазматическими мембранами.
Основные достижения Цитохимии:
1\. Доказаны постоянство количества ДНК в хромосомном наборе,
2\. Участие макромолекул (нуклеиновых кислот и белков) в специфической функциональной активности клетки,
3\. Миграция макромолекул внутри клетки (из ядра в цитоплазму, из тела клетки в отростки и обратно).
Цитохимические исследования проводят в препаратах (мазках или отпечатках) костного мозга, крови, различных органов и новообразований, пунктатов;
они основаны на использовании специфических химических цветных реакций для определения в клетках различных веществ (под действием специально подобранных реактивов происходит окрашивание тех или иных веществ в цитоплазме, а по степени и характеру окраски судят о количестве или активности исследуемых веществ).
Цитохимические исследования относительно несложны, но уступают в точности количественному анализу, проводимому с помощью биохимических методов.
В тех случаях, когда изучаемые вещества локализуются в клетках в виде единичных гранул (например, активность неспецифической эстеразы в лимфоцитах и др.), результат цитохимической реакции целесообразно выражать в процентах клеток, дающих положительную реакцию.
Метод полуколичественной оценки является ориентировочным, но позволяет сравнивать распределение исследуемых веществ в разных клеточных элементах или в одних и тех же клетках при различных патологических состояниях организма, а также в зависимости от течения заболевания, степени его тяжести и в связи с проводимой терапией.
Цитохимический метод может быть использован только в качестве дополнения к морфологическому исследованию, но не может его заменить. Недостатком всех цитохимических реакций является их приблизительная качественная оценка, основанная на степени интенсивности окраски.
ПРИМЕР ВЫЯВЛЕНИЯ ЗЕРНИСТОСТИ ЛИМФОЦИТОВ С ПОМОЩЬЮ Ц\Х МЕТОДА С ПЕРОКСИДАЗОЙ.