Тема 3. Культивирование и рост микроорганизмов.

ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Чистые культуры микроорганизмов. Основные типы питательных сред. Стадии роста культуры.

Цели:

обучения: в результате урока учащиеся должны сформировать понятие о чистой культуре микроорганизмов, о способах культивирования и стадиях роста, обеспечить усвоение учащимися новых знаний, в результате чего учащиеся должны раскрывать сущность понятия «чистая культура» микроорганизмов, описывать типы питательных сред и методы культивирования;

развития: продолжить развитие умения анализировать, сопоставлять, сравнивать, выделять главное, устанавливать причинно-следственные связи; приводить примеры, совершенствовать умение работать с литературой, таблицами, схемами и т.д.;

воспитания: способствовать развитию профессиональной ориентации учащихся;

1. Организационный момент.

2. Целевая установка.

3. Мотивация деятельности учащихся.

4. Изложение нового материала.

План.

1. Типы питательных сред.

2. Стадии роста культуры.

Питательные среды

Выращивание (культивирование) микроорганизмов широко применяется для выделения, накопления и со­хранения их. В лабораторных условиях микроорганиз­мы выращивают при качественном анализе микрофло­ры различных объектов, при количественном анализе — для подсчета жизнеспособных клеток, а в производст­венных условиях — для накопления полезных человеку микроорганизмов и продуктов их обмена веществ.

Среда, используемая в лабораторных условиях для накопления микроорганизмов и продуктов их жизнедея­тельности, называется питательной. К питательным средам для выращивания микроорганизмов предъявля­ют определенные требования: они должны содержать необходимые питательные вещества в легкоусвояемой форме (азотистые, углеводные, минеральные вещества, витамины), должны быть изотоничны по отношению к микробной клетке, обладать буферными свойствами, иметь оптимальную вязкость и определенный оки­слительно-восстановительный потенциал. Обязатель­ное условие — стерильность питательных сред, по­скольку посторонние микроорганизмы изменяют свой­ства среды и затрудняют культивирование и изучение определенных микробов.

Внимание! Универсальных сред, пригодных для всех видов микроорганизмов, не существует. Отдельные виды микробов в зависимости от особенностей обменных про­цессов нуждаются в различных питательных веществах и условиях культивирования.

В качестве питательной среды а ряде случаен ис­пользуют натуральные продукты (картофель, молоко и т. д.). Такие среды называются естественными. Однако чаще питательные среды, используемые в лабораторной практике, являются искусственными, т. е. приготовленными в лаборатории специально для данной цели по определенным рецептам.

Питательные среды различны по составу, консистен­ции и назначению.

Состав сред. В микробиологической практике широко применяют так называемые простые (или обыч­ные) среды, пригодные для культивирования многих видов микроорганизмов. К простым средам для выра­щивания бактерий относят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА). Пептон, мясная вода, входящие в состав этих сред, служат источником азота, углерода, зольных элементов и факторов роста, необходимых для микробной клетки. Простые среды для выращивания микроскопических грибов — неохмеленное пивное сусло и сусло-агар.

Сложные среды готовят, как правило, на осно­ве простых, добавляя к ним питательные вещества, не­обходимые для более требовательных видов микроорга­низмов (например, сахарный бульон, кровяной агар и др.).

Консистенция сред. По консистенции питательные среды бывают жидкими, полужидкими и плотными.

К жидким средам относят мясопептонный буль­он, сусло и др. Уплотнение сред достигается добавлени­ем к жидким средам агар-агара и желатина.

Агар (по-малайски — желе) — плотный волокни­стый материал, получаемый из морских водорослей и образующий в водных растворах плотный гель. Агар растворяется в воде при нагревании и застывает при комнатной температуре. Благодаря способности прида­вать питательному продукту, консистенцию плотного студня и высокой устойчивости к ферментативному дей­ствию микробов агар широко применяется при изготов­лении полужидких (0,5% агара) и плотных (1—2%) питательных сред.

Желатин — белковое вещество животного проис­хождения. Применение его как уплотнителя ограничено из-за низкой (22—27 °С) температуры разжижения.

Плотными средами являются, например, мясопептон­ный агар (МПА), сусло-агар (СА), мясопептонный же­латин.

Назначение сред. В зависимости от задач исследова­ния, кроме простых сред, используемых для выращи­вания многих видов микробов, применяют элективные и дифференциально-диагностические среды.

ПОСЕВ НА ПЛОТНЫЕ СРЕДЫ В ЧАШКАХ ПЕТРИ

Посев осуществляют различными методами в зави­симости от его цели: выращивание микроорганизмов в толще среды или на ее поверхности.

Для глубинного посева (в толще среды) ис­пользуют обычно мерные количества плотной среды, за­готовленные в пробирках по 10—15 мл. Культуру вно­сят в пробирки с расплавленным и охлажденным до 40— 45 °С агаром, а затем заливают смесь в чашку Петри. Возможен и другой способ глубинного посева: взвесь микроорганизмов вносят непосредственно в стерильную чашку Петри на дно, слегка приоткрыв крышку, а затем заливают ее расплавленным и охлажденным агаром. Среду с культурой тщательно перемешивают круговыми движениями чашки, не поднимая ее с поверхности сто­ла. После этого чашку оставляют на столе до застыва­ния агара.

Рис. 7. Посев микроорганизмов на поверхность плотной среды:

а — шпатель Дригальского; б — положение чашки и руки при посеве шпа­телем; в — рост микроорганизмов после рассева шпателем; г — рост микро­организмов после рассева петлей

Для поверхностного роста исследуемый ма­териал наносят на поверхность уже застывшей среды. По пластинке агара материал распределяют с помощью шпателя или бактериологической петли.

При посеве шпателем (стеклянной палочкой, согну­той в виде треугольника) (рис. 7, а) чашка с застывшей средой находится на поверхности стола. Левой рукой слегка приоткрывают крышку, а правой вносят на по­верхность агара определенное количество (петлю, каплю или определенный объем) культуры (б), Круговыми движениями шпателя распределяют культуру по всей поверхности среды (а).

При использовании бактериологической петли посев осуществляют штриховым способом. Чашку Петри кла­дут на стол дном кверху и левой рукой поднимают толь­ко ее основание со средой; держат дно чашки в руке вертикально, и осторожно, не разрывая среду, сеют культуру петлей зигзагообразными движениями (штри­хом) (г).

Рост микроорганизмов - это увеличение числа клеток при развитии в питательной среде. При определении числа клеток пользуются гомогенной суспензией клеток в жидкой среде и оп­ределяют концентрацию бактерий (число клеток на 1 мл). На ос­нове этого показателя в растущей бактериальной культуре можно вычислить константу скорости деления клеток (ее выражают чис­лом удвоений концентрации бактерий за 1 ч) и обратную ей ве­личину - продолжительность (время) генерации (интервал вре­мени, за который число клеток удваивается).

В популяции бактерий не все клетки жизнеспособны. Живыми считаются те, которые могут образовать колонии на агаризованной среде. В общее число клеток включают также мертвые и по­врежденные клетки. Самым распространенным способом опреде­ления общего числа клеток служит их подсчет под микроскопом в тонком слое с помощью «счетной камеры» Горяева-Тома. Мож­но определить число клеток микроорганизмов в питьевой воде, пропустив ее через мембранный фильтр. Затем фильтрат сушат, окрашивают, просветляют и подсчитывают число клеток под мик­роскопом.

При внесении бактерий в свежую питательную среду они обыч­но растут до тех пор, пока содержание каких-нибудь из необхо­димых компонентов среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Если на протяжении этого времени не добав­лять питательных веществ и не удалять конечных продуктов об­мена, то получим так называемую периодическую культуру. Пе­риодическая культура - это популяция клеток в ограниченном жизненном пространстве. Рост в такой «закрытой системе» подчи­няется закономерностям, присущим не только одноклеточным, по и многоклеточным организмам. Периодическая культура ведет себя как многоклеточный организм с генетически ограниченным ростом.

Рис. 8. Фазы развития стационарной микробной культуры.

Кривая, описывающая зависимость логарифма числа живых клеток от времени, называется кривой роста (рис. 8). Типичная кривая роста имеет S-образную форму и позволяет различить не­сколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной после­довательности: начальную, или лаг-фазу, экспоненциальную, или логарифмическую, фазу, стационарную фазу и фазу отмирания.

Рост микроорганизмов на твердых питательных средах проте­кает в основном так же, как и на жидких, но при этом достигают­ся более высокие плотности клеток.

Начальная фаза (лаг-фаза) охватывает промежуток времени меж­ду посевом и достижением максимальной скорости деления. Про­должительность этой фазы зависит от предшествующих условий культивирования и возраста посевного материала, а также от при­годности для роста данной среды. В этот период в бактериальных клетках содержание РНК увеличивается в 8... 12 раз. Это указыва­ет на участие РНК и рибосом в синтезе необходимых ферментных белков.

Экспоненциальная (логарифмическая) фаза характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток. Скорость де­ления в этой фазе зависит от вида бактерий и от среды.

Величина клеток и содержание в них белка остаются постоян­ными.

Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток пере­стает увеличиваться. Скорость роста зависит от концентрации суб­страта. При уменьшении субстрата еще до полного использования его скорость роста снижается, переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит постепенно. Скорость роста может снижаться также из-за большой плотности бактериальной попу­ляции, из-за накопления токсичных продуктов обмена и др. Быс­тро гибнут очень чувствительные клетки, а другие еще могут со­хранять жизнеспособность до тех пор, пока есть возможность по­лучать необходимую энергию в процессе окисления каких-либо запасных веществ или клеточных белков.

Фаза отмирания и причины гибели бактериальных клеток в нормальных питательных средах изучены еще недостаточно. Чис­ло живых клеток может снижаться экспоненциально. Иногда клетки лизируются под действием собственных ферментов (автолиз).

Изучение влияния условий среды на микроорганизмы дает воз­можность выявить условия, ограничивающие или исключающие рост возбудителей порчи и отравлений на продуктах питания.

5. Закрепление новых знаний.

6. Обобщение и систематизация знаний.

7. Подведение итогов. Рефлексия.

8. Домашнее задание.