1.4. Полимеры в биокаталитических процессах

1.4.1. Преимущества иммобилизованных (стабилизированных) биокатализаторов

Возможность использования природных биокатализаторов (ферментов) в различных процессах, протекающих вне живого организма, ограничена особенностями их структуры и свойств. Это относится как к простым, так и к сложным ферментам, имеющим и белковую, и небелковую составляющую (кофермент).

В первую очередь такие ограничения связаны с недостаточной устойчивостью четвертичной структуры ферментов к различным денатурирующим воздействиям – температуре, значению рН среды, действию различных реагентов, способных взаимодействовать с группами активного центра фермента, и влияющих на систему внутримолекулярных взаимодействий в белковой глобуле.

Существенными технологическими недостатками ферментов также являются сложность их выделения из водных сред, где обычно протекают промышленные биотехнологические процессы, и невозможность повторного использования.

Роль указанных недостатков удается в значительной мере преодолеть посредством связывания белковой глобулы с нерастворимым носителем, который можно довольно легко отделить от реакционной смеси и использовать повторно (например, в реакторах с перемешиванием), или в непрерывных процессах, протекающих в колонных реакторах. Более того, связывание макромолекулы фермента с носителем повышает ее конформационную устойчивость, частично предохраняя от воздействия денатурирующих факторов.

Иммобилизация с помощью различных носителей широко используется и для создания биокаталитических систем на основе целых клеток или их фрагментов (органоидов). Стабилизированные (иммобилизованные) ферменты и клетки применяются не только в промышленной биотехнологии, но и в производстве медицинских препаратов, биоинженерных процессах и биоаналитических системах.

1.4.2. Методы получения иммобилизованных (стабилизированных) биокатализаторов

Таблица 1.14.

Системы с иммобилизованными (стабилизированными) биокатализаторами

Полимер	Система
Агароза, сшитые функциональные производные	Нерастворимые системы с иммобилизованным ферментом
Декстран, сшитые функциональные производные	Нерастворимые системы с иммобилизованным ферментом
Целлюлоза, производные	Нерастворимые системы с иммобилизованным ферментом
Полистирол, сшитые функциональные производные	Нерастворимые системы с иммобилизованным ферментом
Полиакриламид, сшитые функциональные производные	Нерастворимые системы с иммобилизованным ферментом
Альгиновая кислота, соли	Нерастворимые системы с иммобилизованными клетками
Каррагеннан	Нерастворимые системы с иммобилизованными клетками
Полимеры винилового спирта (сшитые и модифицированные)	Носители для иммобилизации ферментов и клеток
Полимеры N-винилпирролидона (сшитые и модифицированные)	Носители для иммобилизации ферментов
Полимеры акриламида (сшитые и модифицированные)	Носители для иммобилизации ферментов и клеток

Носителям можно придавать самые разные формы – гранулы, волокона, мембраны, спирали, кольца, ткани и т.д. Хотя материалом для создания гранулированных носителей могут быть и неорганические соединения, большинство промышленных носителей иммобилизованных ферментов изготовлены из полимеров или их композитов.

В отдельных случаях, скажем, для синтеза ферментных лекарственных препаратов, используют водорастворимые полимеры, которые повышают стабильность и длительность циркулирования лекарства в организме.

В настоящее время разработано много методов связывания макромолекул ферментов с носителем. Они основаны на нескольких подходах − адсорбции фермента на поверхности носителя, химическом связывании белковой глобулы с функциональными группами полимера, включении фермента в массу носителя или мембранную систему, способную к диффузионному массообмену.

Адсорбционное связывание макромолекул ферментов с поверхностью носителя − наиболее доступный и простой метод получения стабилизованных биокатализаторов. Однако в этом случае связь белка с носителем недостаточно прочна, и активность препарата довольно быстро падает. Для повышения устойчивости системы, как правило, применяют введение в белковую макромолекулу дополнительных связей путем взаимодействия с низкомолекулярными или олигомерными ди- и полифункциональными сшивающими агентами: олигомерами глутарового альдегида, водорастворимыми карбодиимидами, дифункциональными активированными эфирами, карбонилдиимидазолами.

Химическое связывание фермента без потери активности основано на проведении химических реакций с белковыми группами, не входящими в состав активного центра. Обычно это аминогруппы, в первую очередь ε-аминогруппы звеньев лизина. Для осуществления таких взаимодействий применяют полимерные носители с группами, способными в мягких условиях вступать в реакции алкилирования, ацилирования, образования азометиновых производных. В последнее время большое внимание привлекают носители с функциональными группами, не требующими дополнительного активирования – эпоксидными, активированными сложными эфирными, альдегидными, изоцианатными, изотиоцианатными.

Макромолекулярной основой данных функциональных носителей служат различные природные и синтетические полимеры-полисахариды, в частности сшитые декстраны и агарозы, сополимеры акриламида, винилового спирта, N-винилпирролидона.

При иммобилизации ферментов довольно широко используют носители с ионогенными группами, способными вступать в ионное взаимодействие с функциональными группами белка, а также носители, образующие комплексные соединения, например, с участием атомов переходных металлов.

Многочисленными исследованиями установлено влияние строения полимерного носителя, применяемого для химического связывания фермента, на активность и стабильность получаемой системы.

Включение природных биокаталитических систем в массу полимерного носителя используют для иммобилизации и ферментов и клеток. Такие носители выпускаются в виде гранул, пленок, мембран и волокон. Лучшую проницаемость слоя полимера для субстрата и продуктов реакции обеспечивают более гидрофильные полимеры. Например, гранулы альгината кальция не снижают активность ферментов и клеток ни в процессе иммобилизации, ни при функционировании. Подобные методы стабилизации особенно важны для получения иммобилизованных клеток. Использование мембранных систем для создания иммобилизованных биокатализаторов менее распространено, чем другие рассмотренные выше методы. В ряде случаев применяются микрокапсулированные препараты.

Созданию, исследованию и применению стабилизированных биокаталитических систем посвящено множество публикаций и патентных разработок, которые обсуждались в ряде монографических обзоров.

Как видно из нашего краткого обзора, материалы и препараты на основе высокомолекулярных соединений различного типа находят чрезвычайно широкое применение в медико-биологических областях. Можно отметить ряд существенных особенностей этого направления, заметно отличающих его от многих других областей химии и технологии высокомолекулярных соединений.

• Большинство представителей этой группы – низкомасштабные продукты или специально синтезированные и высокоочищенные партии обычных полимеров. В некоторых случаях годовая потребность в таких полимерах не превышает нескольких килограммов или десятков килограммов.

• Получение многих типов полимеров происходит в аппаратах малого объема, часто стеклянных, оно работает по принципу гибких технологических схем.

• Поскольку многие продукты используют в непосредственном контакте с живым организмом, организация их производства должна соответствовать требованиям стандартов группы GMР (Good Manufacture Practice) или их отечественных аналогов.

• При разработке большинства из упомянутых выше полимеров следует учитывать правила их допуска к применению, определяемые требованиями соответствующих государственных организаций.

Все перечисленное выше накладывает существенный отпечаток на процесс подготовки специалистов-исследователей и технологов в области полимеров медико-биологического назначения.