V Зертханалық жұмыстар

№2 зертханалық жұмыс

Жасуша және ұлпа өсіндісін өсіргенде қолданатын залалсыздандыру

 

 

№3 зертханалық жұмыс

Қоректік ортаның құрамы

Өсімдік жасушаларын өсіретін қоректік ортаны дайындау

 

²ажеттi º½рал-жабдыºтар: 1 л. химиялыº стакандар (4 дана), бастапºы ерiтiндiге арнал¹ан ты¹ыны бар шыны ыдыс, пеницилиннен боса¹ан ºорабшалар (10 дана), 10 мл ж¸не 1 мл. ¼лшемдi тамыз¹ыштар, таразы т¾рлерi (техникалыº, торсион, аналитикалыº),  электрлi плитка, химиялыº реактивтер (ºосымша, 1 кесте).

Т¾сiнiктеме. Оºшаулан¹ан жасуша мен ½лпаны ¼сiруге арнал¹ан ºоректiк ортаны» º½рамында ¼сiмдiк тiршiлiгiне керектi макроэлементтерден азот, фосфор, калий, к¾кiрт, магний, темiр; микроэлементтерден бор, цинк, мыс, марганец ж¸не т.б. , сонымен ºатар, д¸румендер, к¼мiрсулар мен ¼су гормондары болуы керек. Кейбiр ºоректiк орталарды» º½рамына казеин гидролизiнi» ¼нiмдерi мен амин ºышºылдары ºосылады. ²оректiк орта º½рамында ЭДТА (этилендиаминтетросiрке ºышºылы) немесе оны» натрилi т½зы ºосылады, себебi олар жасушаларды» ортадан темiрдi о»ай сi»iруiне ыºпал жасайды. Оºшаулан¹ан жасуша мен ½лпаларды ¼сiруге арнал¹ан ºоректiк ортаны» негiзгi алмастырылмайтын заттарыны» бiрi – к¼мiрсулар, себебi к¼птеген жа¹дайларда со»¹ылар автотрофты ºоректене алмайды. Негiзiнен к¼мiрсу к¼зi ретiнде сахароза мен глюкозаны» 20-40 г/л концентрациясын пайдаланады.

К¼п жа¹дайларда полисахаридтер ºолданылмайды, дегенмен, кейбiр ½лпаларды», мысалы iсiк ½лпаларыны» º½рамында белсендi гидролиттiк ферменттердi» (амилаза ж¸не т.б.) болуына байланысты, олар крахмал ерiтiндiсi бар ºоректiк ортада ¼се бередi.

Гормондар жасушаларды» ¼суi мен б¼лiнуiн ºамтамасыз етедi. Сондыºтан каллус ½лпаларын алу ¾шiн ºоректiк орта º½рамында мiндеттi т¾рде ауксин (жасушаларды» мамандануыны» жойылуын ºамтамасыз етедi)  ж¸не цитокинин (мамандануы жойыл¹ан жасушаларды» б¼лiнуiн ºамтамасыз етедi) болуы шарт.  ´ркеннi» дамуын (морфогенез) ºоздыру ¾шiн ауксиннi» м¼лшерiн азайтады немесе м¾лдем ºоспайды. Гормоны жоº ºоректiк ортада iсiк ж¸не ¾йреншiктi ½лпалар ¹ана ¼се алады.

²оректiк орталарды» º½рамына ауксин тобынан 2,4-Д (дихлорфенолсiрке ºышºылы), индолил сiрке ºышºылы (ИС²), нафтилсiрке ºышºылы  (НС²)  ºолданылады.

Цитокинин ретiнде ºоректiк орта¹а кинетин, 6өбензиламинопурин  (6-БАП), зеатиндi пайдаланады. 6-БАП ж¸не зеатиндi кинетинмен салыстыр¹анда, оºшаула¹ан ½лпаны» ¼суi мен м¾шелердi» т¾зiлуiне белсендi ¸сер етедi. Кейбiр ºоректiк орталарды» º½рамында аденин болады.

²оректiк орта º½рамында ауксин мен циттокининнен басºа, гиберелл ºышºылы (Г²)  болады. Г² болуы мiндеттi емес, бiраº кейбiр жа¹дайларда ол оºшаулан¹ан ½лпаны» ¼суiн жеделдетедi.

Ал¹ашºы ºоздыру мен ¼судi ºамтамасыз ету ¾шiн ºоректiк орта¹а ¼сiмдiк шырынын да ºосады.

Кокос с¾тi - (кокос жа»¹а¹ыны» с½йыº эндоспермi) ¼судi жылдамдатады.

²атты ºоректiк ортаны агарөагарда даярлайды. Агарөагар дегенiмiз – те»iз балдырларынан ¼ндiрiлетiн полисахаридтер ºоспасы. ²ажетсiз ºоспалар аз кездесетiн орта – бактериялы агар (Bacto Agar). Орта¹а 0,7% агар ºосылады.

Уаºыт ¾немдеу ¾шiн макроө, микрот½здар, д¸румендер мен фитогормондарды» ерiтiндiлерiн ºаныººан етiп даярлайды, оларды бiрнеше рет пайдалану¹а болады. Бастапºы ерiтiндiлердi то»азытºышºа ºояды.

´сiмдiктердi» жасушасы, ½лпасы мен м¾шелерiн ¼сiру ¾шiн º½рамы ¸рт¾рлi ºоректiк ортаны пайдаланады. Ке» ºолданылатын ºоректiк орта¹а Мурасиге-Скуг (МС), Уайт, Гамборг, (В₂) орталарын жатºызу¹а болады (ºосымша, 1 кесте).

Ж½мысты» барысы:  Мурасиге-Скуг ºоректiк ортасын дайындау ¸дiсi. ²оректiк орта º½рамы 1-шi кестеде берiлген.

Т½здарды» бастапºа ерiтiндiлерiн дистилденген суда даярлайды ж¸не º½рамы келесiдегiдей болады: 1). NH₄NO₃, KNO₃, MgSO₄. 7H₂O (¸рбiр т½зды жылытып отырып жеке стаканда ерiтедi де, к¼лемiн 1 л-ге жеткiзедi), ал MgSO₄. 7H₂O ерiтiндiсiн жылытпай салºындатыл¹ан ºоспа¹а º½яды, себебi ерiтiндi ыстыº болса т½нба т¾зiледi. 2). СаСI₂; 3). Қайна¹ан¹а дейiн ºыздырыл¹ан темiр хелаты – FeSO₄. Na₂ ЭДТА темiр хелаты т¾зiлуiне ºажет заттар; 4). микроэлементтер. Алын¹ан макро-микроэлементтер ерiтiндiлерiн ты¹ыны бар ыдыстар¹а º½йып (темiр хелатын ºара»¹ы ыдысºа), белгi жасап, то»азытºышºа салады.

Д¸румендердi» ºаныººан ерiтiндiсiн дайындау ¾шiн 10-еселiк ¼лшемiн алып, 10 мл. суда (¸р д¸румендi жеке-жеке қосымша) ерiтедi; 1 мл-де 1 л. МС даярлау¹а ºажеттi д¸румендер м¼лшерi бар. Ерiтiндiлерi пеницилиннен боса¹ан ºорабшаларда м½зда¹ан к¾йiнде саºтайды.

Фитогормондар ерiтiндiлерiн келесiдегiдей дайындайды: 10 мг. ауксиндi (2,4-Д, ИС², НС²) 0,5-2мл. этанолда ерiтедi ж¸не 10 мг. цитокининдi (кинтеин, зеатин, БАП) 0,5н НСI немесе КОН ерiтiндiсiнде ерiтедi, ал абциз ºышºылын (АБК) –70 % этанолда ерiтедi. Содан кейiн ерiтiндiлердi ºыздырып (АБК-дан басºасын), к¼лемi 100 мл. бол¹анша су º½яды (1 мл-де 1 мг гормон бар) . Оларды то»азытºышта 1 ай бойы 4⁰С температурада саºтау¹а болады.

Бастапºы ерiтiндi негiзiнде келесi сабаºтарда пайдалану¹а болатын МС ºоректiк ортасын дайындау¹а болады.

²оректiк ортаны келесiдегiдейдайындайды: 1 л. химиялыº стакан¹а 30г. сахароза салып, дистилденген сумен 400-мл-ге жеткiзiп, сахароза ерiгеннен кейiн осы ерiтiндiге макро,- микрот½здарды» (ºосымша, 1 кесте), д¸румендердi» ж¸не гормондарды» керек м¼лшерiн ºосады. Мiндеттi т¾рде ерiтiндiнi» рН м¼лшерiн ¼лшеу керек, рН 5,5-5,6-дан жо¹ары ºоректiк орта¹а 0,1%  НСI ерiтiндiсiн ºосады. Агар- агарды» бiрºалыпты еруi ¾шiн оны» су¹а салын¹ан ºоспасын электрлi плиткада ºыздырып алады.  Дайын ерiтiндiлердi бiр-бiрiне ºосып, к¼лемiн 1 л.өге жеткiзедi.

 

МС бойынша бастапºы ерiтiндiлердi даярлауды» есебi.

 

Макрот½здар	1 л. бастапºы ерiтiндiге керек заттар м¼лшерi, г	1 л ºоректiк орта жасау¹а кететiн бастапºы ерiтiндi м¼лшерi, мг
KNO3	38	50
NÍ4NO3	33
KH2PO4	34
MgSO4. 7H2O	7,4
CaCI2 . 2H2O	8,8	5
Микрот½здар	100 мл. бастапºы ерiтiндiге керек заттар м¼лшерi, мг	1
H3BO3	620
MnSO4 . 7H2O	2230
ZnSO4 . 7H2O	860
KI	83
Na2MoO4 . әHәO	25
CuSO4 . 5H2O	2,5
CoCI2 . 6H2O	2,5
Fe хелат	100 мл. бастапºы ерiтiндiжасау¹а керек заттар м¼лшерi, мг	5
FeSO4	557
Na2 ÝÄÒÀ	745

 

²оректiк орталарды пробиркалар¹а º½йып (3/1 к¼лемiндей), маºталы ты¹ындармен немесе ºор¹асын ºа¹азымен жауып, автоклавта зарасыздандырады.