2.2.6 Секвенирование.
В основе метода секвенирования ДНК, разработанного Сэнгером и соавт. [Sanger et al., 1977], называемого также методом секвенирования путем терминации цепи, лежит принцип ферментативного построения комплементарной цепи ДНК по существующей одноцепочечной матрице при происходящем в разных местах цепи ДНК ингибировании ее дальнейшего роста. Изначально этот метод был не автоматизирован и состоял из множества этапов:
1) Гибридизация изучаемого фрагмента ДНК с праймером,
2) Ферментативный синтез ДНК,
3) Денатурация полученных продуктов формамидом (в результате образуются уникальные различающиеся по длине олигонуклеотидные последовательности, содержащие праймер),
4) Электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках (по числу типов нуклеотидов)
5) анализ результатов на радиоавтографе. На большинстве радиоавтографов можно было четко различить 250—350 полос, т.е. прочитать последовательность в 250-350 п.н.
Сейчас очень распространены автоматические секвинаторы, которые позволяют ускорить процесс и сократить число этапов. Общая схема секвинирования выглядит так:
1) Выделение ДНК (пункт 2.2.2)
2) Постановка ПЦР для увеличения числа копий нужного фрагмента (пункт 2.2.3)
3) Очистка ПЦР продукта от dNTP и остатков праймеров (пункт 2.2.5)
4) Постановка сиквенсовой реакции (описано будет ниже)
5) Обнаружение флуоресцентно меченых меток при помощи аппарата для секвинирования
6) Анализ результатов
Подробнее остановимся на сиквиенсовой реакции. По своей сути эта реакция напоминает обычную ПЦР, но с использованием флуоресцентно меченым ddNTP.
ПЦР-микс для сиквиенсовой реакции готовится из очищенного амплификата с добавлением отдельно forward и reverse праймеров (3,2 пикаМоль), заводского реагента RR 5х, включающего в себя ddNTP, dNTP, Mg2+, полимеразу, (20% от объема смеси), специального 10х буфера ( 10% от объема смеси) и воды milli-q.
Первый этап сиквенсовой реакции – денатурация, во время этой стадии происходяит расхождение двойной цепочки ДНК. Это осуществляется в результате нагревания раствора содержащего ДНК до 95°С.
Второй этап – отжиг праймеров. В некоторых вариациях во время этого этапа в каждую пробу можно добавлять только один праймер (forward или reverse). Таким образом, можно «перестраховаться» и в спорных ситуациях анализировать фрагмент как в прямом направлении, так и в обратном. Температура и время отжига аналогичны таковым при постановки ПЦР.
Третий этап – элонгация праймера. В этом этапе заключается главное отличие сиквенсовой реакции от ПЦР. В пробирке кроме dNTP, которые комлиментарно достраивают цепочку ДНК находится малая доля и ddNTP. У этих молекул нет кислородной группы в 3’ положении и они флюрисцентно мечены. Первое свойство ddNTP позволяют останавливать элонгацию цепи, так как dNTP не может образовать связи с ddNTP. Второе же свойство используется в дальнейшем для детекции нуклеотидов. В результате третьего этапа в пробирке будет ДНК с одной полной цепью и с комплиментарной ей неполной, начинающейся от праймера (forward или reverse) и заканчивающаяся меченым ddNTP.
Перейдем к описанию генетического анализатора на примере используемого в этой работе 3130 Applied Biosystems Genetic Analyzer. Это устройство представляет собой камеру для вертикального гель электрофореза. Предварительно денатурированная ДНК после сиквенсовой реакции раскапывается в плашку из 96 ячеек. После чего происходит настройка прибора и его запуск. В настройку входит наименование проб, выбора алгоритма секвенирования и обработки результатов (обычно это заводские настройки). После запуска происходит электроинъекция ДНК в капилляры, содержащие гель. Изменяя напряжение создаваемое во время «впрыска», можно регулировать объем ДНК единомоментно поступивший в капилляр. В качестве геля используется ПААГ (концентрация обычно в пределах 4,5-6%), Электрофорез происходит в капиллярах диаметром 50-100 мкм. В капиллярах ДНК движется с разной скоростью – чем она меньше, тем быстрее движется. Таким образом, чем раньше к праймеру присоединился ddNTP, тем быстрее этот фрагмент пройдет через детектирующую ячейку. Капилляры просвечиваются лазером (рисунок 3.), возникающее при этом излучение флюоресценции от меченых ddNTP определенного цвета (и постепенно изменяющейся интенсивности) проецируется оптической системой на входную щель спектрофотометра и падает на отражающую дифракционную решетку. В зависимости от длины волны флюоресценции дифракционная решетка отражает цветной луч в определенное положение на выходе спектрофотометра. Информация об этом положении поступает в компьютер, обеспечивая идентификацию дидезоксирибонуклеотида, которым заканчиваются данные отрезки ДНК (таблица 2). Выходя из спектрофотометра, луч попадает в камеру для измерения его интенсивности, где используется явление фотоэлектронной эмиссии. Соответствующий электрический сигнал также поступает в компьютер.
Рисунок 2. Движение ДНК в капилляре. 1)меченое ddGTP, 2)меченое ddATP, 3)меченое ddCTP, 4)меченое ddTTP, 5) немеченая часть ДНК, 6) капилляр,
7) лазер, стрелкой указано направление движения ДНК
Таблица 3. Пример меченых ddNTP.
Далее следует проанализировать полученные результаты. В данном исследовании мы использовали программы Chromas pro и LaserGene. С их помощью можно сравнить полученную последовательность нуклеотидов у больного с таковой же у здоровых людей (рисунок 3). Метод позволяет анализировать фрагменты длиной порядка 800 п.н. Нами было исследовано 10 экзонов длиной 200-600 п.н. Мутаций и полиморфизмов обнаружено не было.
1)
2)
3)
4)
Р
5)
6)
исунок 3. Рабочее окно программы SeqMan pro. LaserGene. Здесь можно увидеть:1) позицию выбранного участка относительно референсного (исходного, здорового) гена,
2) последовательность нуклеотидов у референсного гена, 3) последовательность нуклеотидов, полученную при секвенировании, 4) направление элонгации (было амплифицировано с прямого или обратного праймера), 5) графики флуорисценции меченых ddNTP, 6) названия сиквенсовых проб.