Графическая оценка констант конкурентного ингибирования

На рис. 6.4 приведен график Лайнуивера-Берка для случая типичного конку­рентного ингибирования. Начальную скорость реакции, V₀, измеряют при разных значениях концентрации S, но при фиксированной концентрации ингибитора.

Рис. 6.4

График Лайнуивера-Берка для случая классического конкурентного ингибирования. +[I] – первая концентрация ингибитора, +2[I] – вторая концентрация ингибитора. Часто начальную скорость реакции обозначают не символом V0, а символом v, как на данном графике.

Прямые, проведенные через полученные экспериментальные точ­ки, отсекают на оси у один и тот же отрезок. Длина этого отрезка, равна величине l/V_max. Это означает, что при бесконечно большой концентра­ции S (1/[S] → 0) V_max будет такой же, как и в отсутствие ингибитора. Однако длина отрезка, отсекаемого на оси х (эта величина определяет значение К_M), в при­сутствии ингибитора уменьшается (–1/K′_M < –1/K_M). Следовательно, конкурентный ингибитор увеличивает кажущееся значение К_M (К′_M) для субстрата. Для про­стого конкурентного ингибирования длина отрезка, отсекаемого на оси х, будет равна:

Зная величину K_M в отсутствие I, из этого уравнения можно определить значение K_I. Значения K_I, для ряда аналогов суб­страта, т.е. конкурентных ингибиторов, показывают, ка­кой из них является наиболее эффективным. Ингибиторы, характеризующиеся наи­меньшими величинами K_I, даже при малых концентрациях могут оказывать сильное ингибирующее действие на активность фермента.

Многие лекарственные препараты, широко использующиеся в клинике, действуют как конкурентные ингибиторы очень важных ферментов, функциони­рующих как в микробных, так и в животных клетках.

Обратимое неконкурентное ингибирование

Как следует из самого термина – неконкурентного ингибирования, в этом слу­чае конкуренция между S и I за сайт связывания отсутствует. При этом ингибитор обычно ничем не напоминает S и, как мо­жно предполагать, связывается в участке фермента, отличном от активного центра. Обратимые неконкурентные ингибиторы снижают максимальную скорость реакции при данном количестве фермента, но, как правило, не влияют на величину K_M. Поскольку I и S связы­ваются с разными центрами, возможно образование как комплекса [EI], так и комплекса [EIS]. Комплекс [EIS] также распадается с образова­нием продукта, однако с меньшей скоростью, чем при распаде комплекса [ES]; поэтому в присутствии таких ингибиторов реакция замедляется, но не останавливается. Ниже указаны возможные варианты образования комплексов [ES], [EI], [EIS] и пути их распада:

На рис. 6.5 представлена зависимость 1/V₀ от 1/[S] в присутствии и в отсутствие ингибитора (предпола­гается, что связывание I не приводит к существен­ным изменениям в структуре активного центра).

Рис. 6.5

Графическое изображение обратимого неконкурентного ингибирования в координатах Лайнуивера-Берка. –I – ингибитор отсутствует, +I – ингибитор присутствует. Начальная скорость реакции обозначена символом v.

Необратимое неконкурентное ингибирование

Ферментативная активность может уменьшаться в присутствии многих «ядов», таких, как иодацетамид, ионы тяжелых металлов (Ag⁺, Hg²⁺), оки­сляющие агенты и т.д. В присутствии одного или нескольких субстратов или продуктов скорость инактивации фермента может снижаться. Кине­тический анализ, применимый к обратимому неконкурентному ингибированию, о котором шла речь выше, может оказаться неприемлемым для того, чтобы отличить действие ферментных ядов от действия неконкурент­ных обратимых ингибиторов. Обратимое неконку­рентное ингибирование встречается сравнительно редко. К сожалению, оно не всегда выявляется, по­скольку и обратимый, и необратимый типы неконкурент­ного ингибирования характеризуются сходной кине­тикой.